在人肝癌細胞特異表達的自主復制型載體及其用途制造技術

一種在人肝癌細胞特異病毒的自主復制型載體及其用途，它是由肝癌細胞特異的啟動子－甲胎蛋白基因的啟動子、ＥＢ病毒質粒型復制子及其反式作用因子、真核細胞抗性選擇標志、和帶大腸桿菌復制子和氨芐青霉素抗性基因的大腸桿菌質粒骨架所組成。它可以非病毒感染的形式將外源基因導入細胞內自主復制和僅在產甲胎蛋白的肝癌細胞才發生特異表達，具有比直接使用重組病毒顆粒直接感染細胞更高的安全性，主要用于原發性肝癌的基因治療，可選擇性殺死腫瘤細胞而不影響正常細胞的功能。（*該技術在2016年保護過期，可自由使用*）

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及一種在人肝癌細胞特異表達的自主復制型載體及其用途，特別涉及外源基因表達為人甲胎蛋基因上游啟動子、增強子所控制的，利用EB病毒質粒型復制元件構建的真核表達質粒載體及其用途。EB病毒屬于皰疹病毒科，它體內可感染人B細胞，同時體外能轉化人B細胞使之永生化，在EB病毒轉化細胞中，病毒一般呈隱性感染狀態，病毒DNA以閉合環狀游離于細胞染色體外自主復制，與宿主染色體DNA復制同步，目前已明確EB病毒質粒型復制僅依賴病毒基因組的兩段序列元件，起順式作用的質粒型復制起始區OriP和反式蛋白EBNA-I的編碼區段，總長度不及病毒基因組的三十分之一。在大腸桿菌質粒中引入EB病毒基因組的這兩段序列元件，可構成一個既能在大腸桿菌中擴增，又能在人細胞自主復制的穿梭載體，它能以較高的轉染頻率導入人細胞表達和復制，同時插入高達幾十kb的外源基因也不影響其附加子特性。(Yates，J.et alStable replication of plasmids derived from Epstein-Barr Virus in variousmammalian cells.Nature 313812)，目前這種含EB病毒復制子的真核質粒多用于真核表達文庫的構建及目標基因的表達上并已有商品化試劑供應，CLONTECH labortories，Inc的pDR2(#6167-1)就是其中之一，外源基因的表達受組成型的啟動子勞氏肉瘤病毒(Rous carcoma virus)的長末端控制，沒有組織特異性。基因治療的興起對腫瘤的治療提出了新的思路。其中有選擇性往腫瘤細胞導入如核酸水解酶、HSV-1胸苷激酶基因等所謂自殺基因，這些基因的表達會導致被導入細胞的死亡，這種工作往往是將自殺基因置于一種腫瘤細胞特異的啟動子控制之下，使基因在腫瘤細胞中特異表達而不影響正常細胞的功能。目前已確定甲胎蛋白基因的調控序列時具有肝癌細胞表達專一性的啟動子，甲胎蛋白是人胚胎期的主要血清蛋白，是由胎肝細胞分泌產生的。在成熟期肝細胞分泌甲胎蛋白的能力已消失，但在原發性肝癌的患者，甲胎蛋白發生異常表達，患者血清中檢出甲胎蛋白是判斷肝腫瘤發生的依據之一。研究已表明控制甲胎蛋白表達的產生是其基因上游的啟動子和增強子序列，(Watanabe，K.et al.，Cell-specific enhancer activity in a far upsteamregion of the human α-fetoprotein gene，J Biol Chem，1987，2624812----4819)，相信是細胞發生癌變時，低分化或不分化的肝癌細胞中，與甲胎蛋白表達有關的一些反式因子的表達激活了甲胎蛋白基因上游的啟動子與增強子所致。Hubber等將甲胎蛋白調控序列克隆于逆轉錄病毒載體，將嵌合了甲胎蛋白上游調控區的外源基因導入表達甲胎蛋白的肝癌組織則獲蛋白活性，而導入正常肝細胞則不表達(Huber，B.E.et al.，Retroviral mediatedgene therapy for the traetment of hepatocellular CarcinomaA innovativeapproach for carcer gene therapy，Proc Natl Acad Sci USA，1991，888039--8043)。但逆轉錄病毒介導基因轉移的表達和復制需將基因整合到細胞的染色體以及重組病毒直接用于人體等，都存在著安全性問題，同時獲得高滴度的重組病毒并非易事，制備重組病毒需將重組病毒載體轉染包裝細胞產生重組病毒顆粒，并需濃縮和純化，過程相對繁瑣。本專利技術的目的是提供一種新型的肝細胞特異表達載體，它可以非病毒感染的形式將外源基因導入體內復制和表達，具有比直接使用逆轉錄病毒顆粒進行轉導更高的安全性。其特點是被導入肝細胞的外源基因不與染色體發生整合行為，游離于染色體外穩定存在并自主復制，它作為一種大腸桿菌、人細胞穿梭質?？稍诖竽c桿菌大量擴增，經簡單的純化就可應用于肝細胞受體介導的基因轉移技術，能以如常規給藥的方式特異地將外源基因導入肝細胞并僅在表達甲胎蛋白的肝癌細胞才發生特異表達。本專利技術的肝癌細胞特異表達的自主復制型載體pEBAF(寄存于大腸桿菌DH5α株，含該質粒的菌種命名為Escherichia coli DH5α/pEBAF，已于1996年2月9日保存于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，登記入冊的編號為CGMCC NO.0255)，見附附圖說明圖1，由下列DNA元件組成1，肝癌細胞表達特異啟動子、增強子--------甲胎蛋白基因上游調控序列。2，甲胎蛋白啟動子、增強子之后有多個單酶切位點BamHI、SalI、PvuII供插入外源基因之用，多克隆位點后是源于SV40病毒的2533---2770bp處的加多聚腺苷酸信號序列。3，人細胞自主復制子及其反式作用因子-------EB病毒質粒型復制所需序列元件OriP、EBNA-I4，真核細胞抗性選擇標志基因(潮霉素B磷酸轉移酶基因)。5，大腸桿菌質粒骨架(包括大腸桿菌復制子和氨芐青霉素抗性β內酰氨酶基因)。本專利技術用于的新型載體構建的原始質粒有如下幾種pDR2Clontech公司商品質粒#6167-1。pAF5.1cat(Watanabe，K.et al.，Cell-specific enhancer activity in a farupsteam region of the human α-fetoprotein gene，J Biol Chem，1987，2624812----4819).pBRCEB病毒95.8株基因組BamHI C片段(3994-----13215bp)克隆于pBR322質粒。pBluescipt II KSStratagene公司商品質粒#212207下面是自主復制型肝癌細胞特異表達載體pEBAF的構建過程1，首先構建不含外源基因啟動子的自主復制型質粒，在pDR2的基礎上刪除質粒上的Rous sarcoma virus的末端重復序列，并引入多個單一限制酶位點，有NotI、XabI、BamHI、SalI、PvuII供插入啟動子之用，此質粒命名為pBV101(寄存于大腸桿菌DH5 α株，含該質粒的菌種命名為Escherichia coli DH5 α/pBV101，已于1996年2月9日保存于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，登記入冊的編號為CGMCCNO.0255)。見附圖2詳細如下從pBRC中切下SacI----SacII 2.7kb含EB病毒復制子的片段，克隆與pBluescript II KS的SacI、SacII位點，得到質粒pKSoriP；再從pKSoriP中以EcoRV、BamHI消化，回收約500bp的片段，與從pDR2中以EcoRV、BamHI消化回收9.5kb的大片段連接，獲得pBV101。2，從pAF5.1cat出發，經過三步亞克隆，刪去cat基因，獲得質粒pAF5.1，人甲胎蛋白基因的啟動子序列可以很方便的從在其3′端引入BamHI單位點切下。3，pAF5.1以XmnI和BamHI消化，回收5.5kp的含人甲胎蛋白啟動子的片本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種在人肝癌細胞特異表達的自主復制型載體ｐＥＢＡＦ，其特征在于由下列ＤＮＡ元件組成：（１）、肝癌細胞表達特異啟動子、增強子－－－－－－甲胎蛋白基因上游調控序列；（２）、甲胎蛋白啟動子、增強子之后有多個單酶切位點ＢａｍＨＩ、ＳａｌＩ、ＰｖｕＩＩ供插入外源基因之用，多克隆位點后是源于ＳＶ４０病毒的２５３３－－－２７７０ｂｐ處的加多聚腺苷酸信號序列；（３）、人細胞自主復制子及其反式作用因子－－－－－－ＥＢ病毒質粒型復制所需序列元件ＯｒｉＰ、ＥＢＮＡ－Ｉ；（４）、真核胞抗性選擇標志基因（潮霉素Ｂ磷酸轉移酶基因）；（５）、大腸桿菌質粒骨架（包括大腸桿菌復制子和氨芐青霉素抗性β內酰氨酶基因）。

【技術特征摘要】

【專利技術屬性】
技術研發人員：顏子穎，侯云德，喬健，李福勝，
申請(專利權)人：中國預防醫學科學院病毒學研究所，
類型：發明
國別省市：11[中國|北京]