腺病毒載體制造技術

含有外源ＤＮＡ序列、源自動物的重組腺病毒在制備用于治療和／或外科處理人體的藥物組合物中的用途。（*該技術在2014年保護過期，可自由使用*）

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及新的病毒載體，它們的制備和基因治療用途。還涉及含有所述病毒載體的藥物組合物。更具體地，本專利技術涉及來自動物的重組腺病毒作為基因治療載體的應用。基因治療在于通過向病體細胞或器官中引入一種遺傳信息以糾正缺陷或異常(突變、異常表達等)。該遺傳信息或在體外引入從器官中取出的細胞中，然后修飾后的細胞再返回機體中，或在體內直接引入適當組織中。在后一情形下，存在不同技術，其中各種轉染技術涉及DNA與DEAE—葡聚糖的復合物(Pagano等，J.Virol.1(1967)891)、DNA與核蛋白的復合物(Kaneda等，Science243(1989)375)、DNA與脂質的復合物(Felgner等，PNAS 84(1987)7413)、脂質體的使用(Fraley等，J.Biol.Chem.255(1980)10431)等。最近，使用病毒作為轉移基因的載體已顯示是這些物理轉染技術的有利替代技術。關于這一點，已經試驗了不同病毒感染某些細胞群的能力。特別是逆轉錄病毒(RSV、HMS、MMS等)、HSV病毒、腺伴隨病毒和腺病毒。在這些病毒中，腺病毒具有用于基因治療的某些令人感興趣的特征。特別是，它具有足夠大的宿主譜，能夠感染休止細胞，不整合在所感染細胞的基因組中。由于這些原因，腺病毒已用于體內基因轉移。實際上已制備了帶有不同基因(β—gal，OTC，α—1AT，細胞因子等)的來自腺病毒的不同載體。現有技術中描述的用于人體基因治療的所有腺病毒載體，迄今為止都是從人源的腺病毒開始制備的。因為這對這種應用似乎是最適合的。為了限制其在體內增殖并形成感染顆粒的可能性，所用腺病毒一般以某種方式修飾使其在所染細胞中無法復制。因此現有技術中描述的構建系為缺失E1(E1a和/或E1b)區及有時缺失E3區的的腺病毒，在此基礎上插入所感興趣的序列(Levrero等，Gene 101(1991)195；Gosh—Choudhury等，Gene 50(1986)161)。然而除這一階段需要修飾外，現有技術中描述的載體還存在其它限制其基因治療應用的缺陷，特別是與野生型腺病毒重組的危險。本專利技術涉及來自動物的重組腺病毒在人體基因治療中的應用。本專利技術基于證實來自動物的腺病毒能夠高效地感染人細胞。本專利技術還基于證實來自動物的腺病毒在已測試的人細胞中不能增殖。本專利技術最后基于來自動物的腺病毒決不會被來自人的腺病毒反式互補這一令人驚異的發現，這完全消除了在人腺病毒存在下在體內重組并增殖，從而導致感染性顆粒形成的危險。這樣，本專利技術的載體就特別有利，因為使用病毒作為基因治療載體的固有危險如病原性、傳播、復制、重組等，都被大大減小，甚至消除。本專利技術因此提供特別適于目標DNA序列在人體中轉移和/或表達的病毒載體。本專利技術的第一個目的涉及含有外源DNA序列的來自動物的重組腺病毒在制備用于治療和/或外科處理人體的藥物組合物中的用途。在本專利技術范圍內可用的動物腺病毒可以是除人腺病毒外的各種來源之腺病毒。人腺病毒是指自然感染至人體的腺病毒，一般用HAd或Ad表示。具體講，本專利技術范圍內可用的動物來源腺病毒可來自狗、牛、鼠(如Mav1，Beard等，Virology75(1990)81)、羊、豬、禽類或猴(例如SAV)。更具體講，禽類腺病毒中可列舉出可在ATCC得到的血清型1—10，例如毒株Phelps(ATCC VR—432)、Fontes(ATCC VR—280)、P7—A(ATCC VR—827)、IBH—2A(ATCC VR—828)、J2—A(ATCC VR—829)、T8—A(ATCC VR—830)、K—11(ATCCVR—921)或編號為ATCC VR—831至835的毒株。在牛腺病毒中，可使用不同的已知血清型，特別是可在ATCC以編號ATCCVR—313、314、639—642、768和769得到的那些(1—8型)。還可舉出鼠腺病毒FL(ATCC VR—550)和E20308(ATCC VR—528)，5型(ATCC VR—1343)或6型(ATCC VR—1340)羊腺病毒；豬腺病毒(5359)，或猴腺病毒，特別是如ATCC編號為VR—591—594、941—943、195—203等的腺病毒。在本專利技術范圍內優選使用來自狗的腺病毒，特別是所有CAV2腺病毒株〔例如Manhattan株或A26/61(ATCC VR—800)〕。狗腺病毒已作為許多結構研究的對象。例如，現有技術中已描述了腺病毒CAV1和CAV2的完全限制圖譜(Spibey等，J.GenVriol.70(1989)165)，已對E1a、E3基因以及ITR序列進行了克隆和測序(特別見Spibey等，Virus Res.14(1989)241；Linne，Virus Res.23(1992)119，WO 91/11525)。另外，狗腺病毒已被用于制備免疫狗抗狂犬病、細小病毒等的疫苗(WO 91/11525)。但迄今為止，這些現有技術中從未提出使用這些腺病毒進行人體中基因治療的可能性。而且從未測試過這種應用的益處。本專利技術范圍內使用的腺病毒應優選缺陷型，即在被給予的生物體中不能自主增殖。如上文所述，申請人已證明這些源自動物的腺病毒能夠感染人細胞，但不能在其中增殖。在此意義上講，它們在人體中是天然缺陷的，并且與使用人腺病毒不同，不需要為此進行遺傳改造。雖然如此，這些腺病毒的缺陷特征還可以通過基因組的遺傳改造而擴大，特別是所述病毒在細胞中復制所需序列的改造。這些區域或被消除(全部或部分)，或使得非功能化，或通過插入別的序列，特別是外源DNA序列來改造。根據腺病毒的來源，復制所需序列可有些不同。然而它們一般位于靠近基因組末端的位置。例如對于CAV—2，已鑒定、克隆并測序了E1a區(Spibey等，Virus Res.14(1989)241)。它位于腺病毒基因組左端的2kb片段上。另外，還可以在這些腺病毒上進行別的遺傳改造，特別是為了避免產生在人體中不利的病毒蛋白，為了能夠插入大片段外源DNA序列，和/或為了插入由另一動物或人腺病毒基因組決定的區域(例如E3基因)。在本專利技術的意義上，“外源DNA序列”指引入病毒并希望其在人體中轉移和/或表達的所有DNA序列。具體講，外源DNA序列可包括一種或多種治療基因和/或編碼治療多肽的一種或多種基因。在一個具體實施方案中，本專利技術更具體涉及來自動物的腺病毒用于制備旨在轉移治療基因至人體的藥物組合物。可被如此轉移的治療基因是在靶細胞中轉錄及有時翻譯后產生具有治療效果的產物的所有基因。這特別涉及具有治療效果的蛋白產物的編碼基因。這樣編碼的蛋白產物可為蛋白質、肽、氨基酸等。該蛋白產物可與靶細胞同源(即在不產生任何疾病的情況下在靶細胞中正常表達的產物)。在此情況下，某一蛋白的表達例如可以減緩由某一變化引起的在細胞中表達不足或表達的蛋白無活性或活性弱，也可以使所述蛋白過量表達。治療基因還可以編碼某一細胞蛋白的穩定性提高、活性改進等的突變體。這種蛋白產物也可以是對靶細胞異源的。此時，所表達的蛋白例如可補充或提供在細胞中不足的某一活性，以此來防治某種疾病。本專利技術意義上的治療產物中，特別可列舉酶、血衍生物、激素、淋巴因子白細胞介素、干擾素等(FR9203120)，生長因子、神本文檔來自技高網...

【技術保護點】

【技術特征摘要】

【專利技術屬性】
技術研發人員：H·哈達德，B·科隆歐思基，M·伯里考迪特，E·威格尼，
申請(專利權)人：羅納布朗克羅萊爾股份有限公司，
類型：發明
國別省市：