同種異體皮膚細胞的培養方法技術

本發明專利技術涉及一種人體皮膚細胞的培養方法，為解決皮源少等問題而研制。該方法是先取少量皮膚組織制成皮片，處理并沖洗至無油滴。將皮片置入皮細胞消化液中冷消化，分離出表皮細胞和真皮成纖維細胞，再分別置入涂有鼠尾膠源的培養瓶中，加足由ＤＭＥＭ、ＦＣＳ、胰島素、氫化可的松、青鏈霉素及兩性霉素混合配制的培養液，分別在３７℃、５％ＣＯ↓［２］環境中培養。處于增殖高峰的表皮細胞和真皮成纖維細胞可分期進行同種異體創面移植。（*該技術在2013年保護過期，可自由使用*）

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及一種人體皮膚細胞的培養方法，更確切地說是涉及同種異體皮膚的培養方法。對于大面積深度燒傷及外傷性皮膚缺損等患者的創面修復治療，目前大都采用自家植皮或自體皮漿、異體供皮等方法，存在皮源少、取皮植皮方法繁鎖、患者痛苦大、創面愈合時間長、術后殘留疤痕等問題。為解決皮源缺乏及皮膚缺損的修復治療問題，近年來國內外相繼開展了人體皮膚細胞的體外培養工作及研究生產人工合成生物敷料等。人體皮膚細胞包括表皮細胞及真皮成纖維細胞，兩種細胞同時培養則存在細胞間的吞噬作用，目前僅有表皮細胞的培養及其用培養的同種異體表皮細胞覆蓋創面的報導，但存在覆蓋創面愈合不牢固、不耐磨、易破損而形成潰瘍、疤痕等缺陷。本專利技術的目的是研究，特別是真皮成纖維細胞的培養方法。本專利技術的方法對同種異體皮源進行表皮細胞和真皮成纖維細胞的分別培養，在兩種細胞培養達到增殖高峰時，分期分別進行同種異體創面移植，達到早期愈合創面的治療目的。本專利技術是在嚴格無菌條件下取同種異體健康者的少量皮膚組織，一般為1-2cm2，用洗液洗干凈，洗液采用D-Hank′s液，加入防細菌感染的青霉素100萬單位/ml、鏈霉素100μg/ml及兩性霉素0.25μg/ml，然后剪除皮下脂肪組織等，制成中厚皮片，再用上述洗液充分沖洗皮片至無油滴為止。取0.02%EDTA和0.25%胰蛋白酶，按1∶1體積比混合，加入防細菌污染的青霉素100萬單位/ml、鏈霉素100μg/ml及兩性霉素0.25μg/ml，配制成皮細胞消化液。通常EDTA和胰蛋白酶是單獨應用的，胰蛋白酶毒性大但細胞消化作用快，EDTA毒性小但細胞消化作用慢，本專利技術將它們混合應用。將處理好的皮片置入皮細胞消化液中，在4℃的環境中冷消化12-18小時，分離出表皮組織和真皮組織，然后再次分別進行30-60分鐘消化，分離出表皮細胞和真皮成纖維細胞。在皮片消化過程中準備培養瓶，將幫助細胞貼壁的鼠尾膠源鋪滿瓶底，瓶口用氨水棉球塞堵，約15分鐘后鼠尾膠源凝固，再用加有青霉素100萬單位/ml、鏈霉素100μg/ml及兩性霉素0.25μg/ml的D-Hank′s洗液清洗干凈放入37℃、5%CO2的培養箱內備用。按4∶1體積比混合DMEM培養基和小牛血清FCS，如果制備100ml的培養液，則DMEM取80ml，小牛血清取20ml，再按比例加入胰島素5μg/ml，氫化可的松0.5μg/ml，青霉素100萬單位/ml，鏈霉素100μg/ml及兩性霉素0.25μg/ml，配制成復合培養液。所配制的復合培養液，PH值為中性，一般在7.2～7.4間，不用再調整。如果不滿足則用碳酸氫納或鹽酸調整到中性。通常皮細胞培養液中還包括有促進表皮生成的表皮生長因子，但本專利技術實施例中沒有采用，效果更好。將分離好的表皮細胞和真皮成纖維細胞分別置入經處理過的培養瓶中，加足復合培養液，25ml的培養瓶一般加3～5ml的復合培養液，放入37℃、5%CO2的培養箱內分別培養表皮細胞和真皮成纖維細胞，實驗表明0.5～1cm2的皮源，可在25ml的培養瓶內，各制備3瓶表皮細胞和3瓶真皮成纖維細胞。表皮細胞4天有細胞分裂相出現，7～10天達到增殖高峰，真皮成纖維細胞7天左右有細胞分裂相出現，二周達到增殖高峰。在兩種細胞的培養過程中，根據細胞的生長情況，決定加或不加L-谷氨酰胺，細胞生長不好有自然老化現象時則加，細胞生長好則不加或少加。而通常情況下，L-谷氨酰胺是作為復合培養液的成份之一的。按本專利技術的培養方法共培養表皮細胞38次，細胞均在7～10天達到增殖高峰，共培養真皮成纖維細胞26次，細胞均在二周左右時達到增殖高峰。將培養瓶內壁上的細胞分別用前述皮細胞消化液消化下來，制成每ml培養液含2×106個細胞的細胞懸液，根據創面大小，先涂灑真皮成纖維細胞懸液，經3～5天真皮成纖維細胞成活后，再將表皮細胞懸液呈點狀移植于網狀支架結構的真皮成纖維細胞上。上述移植，共做臨床應用12例，創面一般在細胞分期移植后2～3周愈合，治愈率100%。移植后的創面更接近正常皮膚組織，并無殘留疤痕、細胞較為牢固，經臨床觀察，亦無明顯排斥反應，用X小體、Y小體鑒定證實為給體者的皮膚組織細胞。本培養方法的優點是取少量的皮膚組織可培養出大量的皮膚細胞，修復大面積的創面，不僅解決了皮源少的困惑，而且避免了患者取皮、植皮等治療上的繁鎖過程及痛苦，同時縮短了療程。權利要求1.一種同種異體皮膚的培養方法，其特征在于是采用下列操作1)取健康者皮膚組織，剪除皮下脂肪，制成中厚皮片，用加入青霉素100萬單位，鏈霉素100μg/ml及兩性霉素0.25μg/ml的D-hank′s洗液充分沖洗至無油滴；2)取0.02%EDTA和0.25%胰蛋白酶，按1∶1體積比混合，按比例注入青霉素100萬單位/ml，鏈霉素100μg/ml及兩性霉素0.25μg/ml，配制成皮細胞消化液，將處理好的皮片置入皮細胞消化液中，在4℃環境中冷消化12～18小時，分離出表皮組織和真皮組織，再次分別進行30～60分鐘消化，分離出表皮細胞和真皮成纖維細胞；3)將幫助細胞貼壁的鼠尾膠源鋪滿培養瓶底，瓶口用氨水棉球塞堵，在鼠尾膠源凝固后用注入青霉素100萬單位/ml，鏈霉素100μg/ml及兩性霉素0.25μg/ml的D-hank′s洗液清洗干凈；4)按4∶1體積比混合DMEM培養基和小牛血清FCS，按比例加入胰島素5μg/ml，氫化可的松0.5μg/ml，青霉素100萬單位/ml，鏈霉素100μg/ml及兩性霉素0.25μg/ml配制成復合培養液，將分離好的表皮細胞和真皮成纖維細胞分別置入上述培養瓶中，加足復合培養液，在37℃，5%二氧化碳培養箱內分別培養表皮細胞和真皮成纖維細胞。2.根據權利要求1所述的，其特征在于所述的操作步驟4)中，由細胞生長情況加入表皮生長因子L-谷氨酰胺。全文摘要本專利技術涉及一種人體皮膚細胞的培養方法，為解決皮源少等問題而研制。該方法是先取少量皮膚組織制成皮片，處理并沖洗至無油滴。將皮片置入皮細胞消化液中冷消化，分離出表皮細胞和真皮成纖維細胞，再分別置入涂有鼠尾膠源的培養瓶中，加足由DMEM、FCS、胰島素、氫化可的松、青鏈霉素及兩性霉素混合配制的培養液，分別在37℃、5％CO文檔編號C12N5/02GK1074708SQ9310165公開日1993年7月28日 申請日期1993年2月22日 優先權日1993年2月22日專利技術者岳毅, 王彧 申請人:北京郵電醫院本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種同種異體皮膚的培養方法，其特征在于是采用下列操作：１）取健康者皮膚組織，剪除皮下脂肪，制成中厚皮片，用加入青霉素１００萬單位，鏈霉素１００μｇ／ｍｌ及兩性霉素０．２５μｇ／ｍｌ的Ｄ－ｈａｎｋ′ｓ洗液充分沖洗至無油滴；２）取０．０２％ＥＤＴＡ和０．２５％胰蛋白酶，按１∶１體積比混合，按比例注入青霉素１００萬單位／ｍｌ，鏈霉素１００μｇ／ｍｌ及兩性霉素０．２５μｇ／ｍｌ，配制成皮細胞消化液，將處理好的皮片置入皮細胞消化液中，在４℃環境中冷消化１２～１８小時，分離出表皮組織和真皮組織，再次分別進行３０～６０分鐘消化，分離出表皮細胞和真皮成纖維細胞；３）將幫助細胞貼壁的鼠尾膠源鋪滿培養瓶底，瓶口用氨水棉球塞堵，在鼠尾膠源凝固后用注入青霉素１００萬單位／ｍｌ，鏈霉素１００μｇ／ｍｌ及兩性霉素０．２５μｇ／ｍｌ的Ｄ－ｈａｎｋ′ｓ洗液清洗干凈；４）按４∶１體積比混合ＤＭＥＭ培養基和小牛血清ＦＣＳ，按比例加入胰島素５μｇ／ｍｌ，氫化可的松０．５μｇ／ｍｌ，青霉素１００萬單位／ｍｌ，鏈霉素１００μｇ／ｍｌ及兩性霉素０．２５μｇ／ｍｌ配制成復合培養液，將分離好的表皮細胞和真皮成纖維細胞分別置入上述培養瓶中，加足復合培養液，在３７℃，５％二氧化碳培養箱內分別培養表皮細胞和真皮成纖維細胞。...

【技術特征摘要】

【專利技術屬性】
技術研發人員：岳毅，王，
申請(專利權)人：北京郵電醫院，
類型：發明
國別省市：11[中國|北京]