雜種單克隆抗體的生產(chǎn)方法及其應(yīng)用技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)提供了一種雙特異性的雜種單克隆抗體，它的兩種特異性分別針對纖維蛋白和血栓溶解物質(zhì)；還提供了一種產(chǎn)生所述抗體的多雜交瘤和一種血栓溶解藥劑，該藥劑含有所述抗體和與其免疫偶聯(lián)的血栓溶解物質(zhì)。所述抗體與血栓溶解物質(zhì)結(jié)合可用于選擇性地和高效率地溶解或去除血栓。（*該技術(shù)在2009年保護過期，可自由使用*）

【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】

本專利技術(shù)涉及一種雜種單克隆抗體。更具體地說，本專利技術(shù)涉及一種具有兩種特異性的雜種單克隆抗體(后面簡稱為雜種MoAb)，這兩種特異性分別針對纖維蛋白和血栓溶解物質(zhì);并涉及一種產(chǎn)生所述抗體的多雜交瘤(polydoma)。本專利技術(shù)還涉及一種血栓溶解藥劑，它含有上述的雜種MoAb和與其免疫偶聯(lián)的血栓溶解物質(zhì)。血栓溶解療法長期以來被用于治療血栓類疾病，例如心肌梗塞、動脈栓塞和大腦梗塞;最初，臨床應(yīng)用的有效的血栓溶解藥劑是鏈激酶(后面縮寫為SK)、尿激酶(后面縮寫為UK)等。UK的應(yīng)用尤其廣泛，因為它有較強的纖維蛋白溶解作用;但其不利之處在于它對纖維蛋白的選擇性很低，它也作用于纖維蛋白原，從而引起受療病人的出血傾向。由于這一弊病，組織血纖維蛋白溶酶原活化因子(后面縮寫為TPA)和尿激酶原(后面縮寫為ProUK)被作為第二代血栓溶解藥劑使用。與UK相比較，這些藥劑對于纖維蛋白具有更高的選擇性，因此可望減輕UK引起出血傾向的副作用;到目前為止已進行了許多研究。近年來，由于利用基因重組技術(shù)已能夠大量生產(chǎn)這些藥物，人們?nèi)找媾υ噲D將它們用于臨床治療中(歐洲重組組織型血纖維蛋白溶酶原活化因子合作研究小組TheLancet，842，1985)。但這些臨床應(yīng)用的努力揭示出TPA等也具有某些缺陷，例如，1)TPA的半壽期很短(2-3分鐘)，因此對于血栓溶解來說要求進行大量長期的施用;2)這種高劑量治療并不總是具有減輕出血傾向的效應(yīng)。在這種情況下，研究并開發(fā)了更有效的血栓溶解藥劑，已經(jīng)生產(chǎn)了修飾過的TPA、UK-TPA或ProUK-TPA雜種蛋白等。對于修飾型TPA來說，已通過基因工程制備了缺乏部分糖鏈結(jié)構(gòu)的TPA突變蛋白，這部分結(jié)構(gòu)被認為是半壽期降低的原因。這樣就避免了肝細胞糖鏈受體對TPA的捕獲，改善了TPA在血液中的動力學狀況。對于UK-TPA雜種蛋白來說，UK的強血栓溶解作用和TPA的纖維蛋白親和性被結(jié)合利用，從而降低了施用劑量。與傳統(tǒng)的血栓溶解藥劑相比較，這些藥劑雖然可望稍微減輕出血傾向，但顯著的改善作用仍有待于進一步的研究和開發(fā)。以后又出現(xiàn)了第三代血栓溶解藥劑，即以定靶抗體為基礎(chǔ)的蛋白復(fù)合物。也就是說，通過化學方式使基本上不與纖維蛋白原反應(yīng)而僅對纖維蛋白具有高親和性的抗體與UK(C.Bode等人，Science229∶765，1985)或TPA(M.S.Runge等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA84∶7659，1987)結(jié)合，從而開發(fā)出了僅溶解纖維蛋白而不溶解纖維蛋白原的血栓溶解藥劑。據(jù)報道，在離體或活體實驗中，所有這些定靶抗體的血栓溶解藥劑都表現(xiàn)出比簡單的UK或TPA強3-100倍的效應(yīng)。但是，這些蛋白復(fù)合物都具有由抗體與血栓溶解酶的化學結(jié)合帶來的缺陷，例如，1)抗體活性與酶活性都在化學結(jié)合過程中有所降低;2)很難得到抗體與酶的比例為1∶1的蛋白復(fù)合物;或3)蛋白質(zhì)的變性加速了藥劑在受療病人體內(nèi)的代謝。附圖說明圖1顯示由參考實例2所述的EIA法制備的抗TPA特異性抗體TPA1-41和TPA1-70的稀釋曲線(見實例2)。圖2顯示由參考實例3所述的EIA法制備的抗UK特異性抗體UK1-3和UK1-87的稀釋曲線(見實例3)。圖3顯示由參考實例8所述的EIA法制備的抗TPA-抗人纖維蛋白雙特異性抗體FT2-14的稀釋曲線(見實例4)。圖4顯示由參考實例9所述的EIA法制備的抗UK-抗人纖維蛋白雙特異性抗體FU1-74的稀釋曲線(見實例5)。圖5顯示實例4-③制備的雙特異性抗體FT2-14與偶聯(lián)有纖維蛋白的紙圓片的結(jié)合量。在圖5中，■顯示在纖維蛋白原(3mg/ml)存在下得到的結(jié)果;□顯示在沒有纖維蛋白原存在時得到的結(jié)果(見實例6)。圖6顯示TPA與實例4-③制備的雙特異性抗體FT2-14構(gòu)成的免疫復(fù)合物(●)與簡單TPA(○)之間的酶活性比較結(jié)果(見實例7)。圖7顯示TPA在用實例4-③制備的雙特異性抗體FT2-14預(yù)處理并結(jié)合有纖維蛋白的Cellulofine顆粒上(TPA/FT2-14)和在未處理的結(jié)合有纖維蛋白的Cellulofine顆粒上(TPA)溶解纖維蛋白的能力(見實例8)。圖8顯示簡單UK以及UK和實例5-③制備的雙特異性抗體FU1-74構(gòu)成的免疫復(fù)合物的纖維蛋白溶解能力(見實例9)。圖9顯示單獨使用TPA或結(jié)合使用TPA和實例4-③制備的雙特異性抗體FT2-14所得到的纖維蛋白溶解能力(○)，以及單獨使用UK或結(jié)合使用UK和實例5-③制備的雙特異性抗體FU1-74所得到的纖維蛋白溶解能力(●)(見實例10)。圖10顯示在家兔頸靜脈血栓模型中，實例4-③制備的雙特異性抗體FT2-14對TPA血栓溶解能力的增強結(jié)果(見實例11)。圖11顯示小鼠雜交瘤FU2-16的培養(yǎng)上清液的稀釋曲線，該雜交瘤是實例13制備的，它能夠產(chǎn)生抗UK-抗人纖維蛋白的雙特異性抗體(見實例13)。圖12顯示通過參考實例3和10所述的EIA法制備的UK1-3、1-87和1-6各自的稀釋曲線(見實例3、12和14)。圖12(A)顯示與UK的反應(yīng)性;圖12(B)顯示與低分子量UK的反應(yīng)性。圖13顯示由參考實例11所述的UK酶活中和測試法得到的抗UK單克隆抗體UK1-3、1-87和1-6各自的酶活抑制曲線(見實例3、12和15)。為了解決上述有關(guān)活體中代謝、纖維蛋白親和性、血栓溶解能力等問題，并考慮到最近發(fā)展起來的雙特異性雜種單克隆抗體這一新技術(shù)，本專利技術(shù)者制備了一種雙特異性雜種單克隆抗體與血栓溶解物質(zhì)比例為1∶1的免疫復(fù)合物，它們的抗體活性和血栓溶解活性都沒有下降。制備方法是使血栓溶解物質(zhì)與雙特異性雜種單克隆抗體免疫偶聯(lián)，從而產(chǎn)生一種沒有副作用的特異于纖維蛋白的血栓溶解藥劑。因此，本專利技術(shù)提供了一種雙特異性雜種MoAb，它的兩種特異性分別針對纖維蛋白和血栓溶解物質(zhì);并提供了一種產(chǎn)生此抗體的多雜交瘤。本專利技術(shù)還提供了一種血栓溶解藥劑，它含有上述雙特異性雜種單克隆抗體和與其免疫偶聯(lián)的一種血栓溶解物質(zhì)。任一種產(chǎn)生抗纖維蛋白抗體的雜交瘤都能用于本專利技術(shù)中，只要它產(chǎn)生特異于纖維蛋白并基本上不與纖維蛋白原結(jié)合的MoAb就行。例如，使用通過纖維蛋白溶解產(chǎn)生的纖維蛋白的α-鏈N端肽段或β-鏈N端肽段作為免疫原可制備這樣一種特異于纖維蛋白的抗體(K.Y.Hui等人，Science222∶1129，1983，或日本未審查專利公開93800/1988)。雖然任一種纖維蛋白都可接受，只要是動物來源的就行，但優(yōu)選人纖維蛋白;尤其優(yōu)選的是，使用相應(yīng)于人纖維蛋白β鏈N端部分的肽。使這樣得到的纖維蛋白特異性抗體與載體蛋白偶聯(lián)，然后免疫動物(如家兔、大鼠、小鼠、豚鼠)而得到抗體生成細胞。然后從免疫動物體內(nèi)收集抗體生成細胞如脾細胞或淋巴結(jié)細胞，并與骨髓瘤細胞相融合。對這樣得到的雜交瘤細胞進行篩選，選出基本上不與纖維蛋白原反應(yīng)而與纖維蛋白特異結(jié)合的抗體生成細胞。人纖維蛋白β鏈N端肽最好具有如下氨基酸順序H-Gly-His-Arg-Pro-Leu-Asp-Lys-R-Cys-OH其中，R代表一個由Lys-Arg-Glu-Glu代表的肽或其部分。C端的Cys用來作為與載體蛋白化學結(jié)合的接頭部分。因此，通過預(yù)先用N-(γ-馬來酰亞胺丁酰氧基)琥珀酰亞胺(后面本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護點】
一種產(chǎn)生雙特異性雜種單克隆抗體的多雜交瘤，該抗體的兩種特異性分別針對纖維蛋白和血栓溶解物質(zhì)。

【技術(shù)特征摘要】
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【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：巖佐進，黑川智文，田幸生，
申請(專利權(quán))人：武田藥品工業(yè)株式會社，
類型：發(fā)明
國別省市：JP[日本]