胰島素類似物的制備方法技術

本發明專利技術提供了新的速效人胰島素類似物，其自身結合成二聚物、四聚物、六聚物或多聚物的傾向較小。該新的人胰島素類似物是通過用天然存在的氨基酸殘基取代人胰島素中的一個或多個氨基酸殘基的方法得到的。氨基酸殘基取代基最好比分子的相應位置上的天然氨基酸殘基更親水。另外，該胰島素類似物在中性ｐＨ值時與人胰島素相比，具有相同或更大的負電性。氨基酸取代基以天冬氨酸、谷氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、組氨酸和異亮氨酸為好，向更好的取代基是天冬氨酸和谷氨酸。該新的胰島素類似物可以用于速效胰島素溶液的制備。（*該技術在2006年保護過期，可自由使用*）

【技術實現步驟摘要】
本專利技術是關于一種以皮下注射后立即產生作用為特征的新型人類胰島素類似物，含有這種胰島素類似物的胰島素注射液和制備這種胰島素類似物的方法。在治療糖尿病中，技術人員已提出許多種胰島素配制品，其中一些是速效的，而另外一些或多或少有延遲作用。在急癥情況下，像高血糖昏迷，外科手術、懷孕期間和嚴重感染時可以使用速效胰島素制劑。此外，每天多次注射速效胰島素制劑可改進那些已表明是難以用長效胰島素控制的糖尿病人的病情控制。最近幾年，對一個用胰島素治療方法產生了愈來愈大的興趣，該方法研究了健康組織的β細胞中胰島素的分泌，即，與餐食相聯系地補充胰島素，並維持一個基本的胰島素水平。臨床觀察表明糖尿病患者借助于每天一次注射長效胰島素以滿足基本的需要，並在主餐之前補充注射少量的速效胰島素就能夠獲得接近于正常的胰島素和葡萄糖濃度。在治療既需要中效和長效胰島素的推遲作用，又需要較強的起始效應的糖尿病患者時，還可以將速效胰島素與中效和長效胰島素混合使用。最后，速效胰島素可應用在連續的胰島素輸送系統中。皮下注射速效胰島素溶液，已觀察到吸收時有一個初始延遲(Binder，Diabetes Care 7.NO.2(1984)，188-199)，然而，當目標是嚴格的代謝控制時，這種由較慢開始作用引起的延遲吸收是不希望的。將速效胰島素溶液與長效胰島素制劑混合還會進一步使速效胰島素的吸收速率降低。因此，需要有一種皮下注射后較快發生作用的、並且改進與長效胰島素制劑的混溶性的速效胰島素溶液。已知的速效胰島素溶液的另一個缺點是在用于連續輸注胰島素的胰島素溶液中，胰島素有形成微纖維並從該溶液中沉淀出來的趨勢，因而阻塞了機械部件和輸送導管。最后，還需要另一種治療對正常胰島素具有耐受性的病人用的胰島素制劑。本專利技術的目的是提供一種具有以下一種或多種改進特性的新型速效胰島素溶液。1)通過皮下注射或其他給藥途徑，能較快發生作用。2)改進了與延遲胰島素配制品的混溶性。3)降低了在用于可植入的輸送系統時產生微纖微的趨勢。4)適用于耐藥性病人的治療(對先前存在的抗體具有低的親和性)。用下文描述的新型可注射的人胰島素類似物的水溶液可達到本專利技術的目的。過去已介紹過大量的胰島素類似物，Marki等人(Hoppe-Seyler′s Z.Physiol.Chem，360(1979)，1619-1632)介紹了人胰島素類似物的合成，這些胰島素類似物在A鏈的2，5，6，7，8和11位，和B鏈的5，7，13和16位中單氨基酸的取代上不同于人胰島素。從而對頗感興趣的胰島素的結構與活性的關系有了深入了解。其他研究改進了胰島素(B(22)-β(26))內主要受體的結合區域，以了解這種變異對受體結合活性的影響。然而，已知的人胰島素類似物不能呈現出本專利技術人所要求的這些性質。眾所周知，硫酸鹽化的胰島素形成微纖維的趨勢較低(Albisser等人，用于輸注泵的胰島素的理想特性，InGueriguian J.L等人，eds.US Pharmacopeial Convention，Rockwille，Maryland，Pp.84-95)並呈現一種抵抗原性。然而硫酸鹽化的胰島素是一種至少有幾種不同的、平均每個分子含有4.5個硫酸鹽酯基團的胰島素衍生物的非均勻混合物。此外，硫酸鹽化的胰島素具有一個低的胰島素活性，大約是原來胰島素活性的20%，與原胰島素比較，硫酸鹽化胰島素的另一個缺點是它們不需要含有通過化學方法改進的氨基酸殘基，即不是自然存在的氨基酸。本專利技術的另一個目的是提供同類的胰島素類似物，生物活性要高于硫酸鹽胰島素，最好只含有天然存在的氨基酸。這里所用的“胰島素類似物”意思是指一種具有與人胰島素分子結構類似的化合物，包括在A(7)Cys和B(7)Cys之間、A(20)Cys和B(19)Cys之間含有二硫化物橋，在A(6)Cys和A(11)Cys之間含有一個內二硫化物橋，並具有胰島素活性。本專利技術基于一個意外的情況，就是在某些胰島素類似物中至少有一個氨基酸殘基已被天然存在的氨基酸基所取代，而呈現出令人希望的速效活性。廣義講，本專利技術通過用天然存在的氨基酸殘基取代人胰島素的一個或多個氨基酸基，提供了一種新型的速效人胰島素類似物，它降低了自身聯合成二聚物、四聚物、六聚物或多聚物的趨勢，並在中性pH值將具有與人胰島素相同的或更大的負電荷。為了降低自身聯合成二聚物、四聚物、六聚物或多聚物的趨勢，最好在分子的相應位置上用比天然氨基酸基親水性更強的其他氨基酸基取代人胰島素的某些殘基。也可以在胰島素分子的某些位置上用更龐大的氨基酸基取代，從而降低胰島素分子聯合成二聚物、四聚物、六聚物或多聚物的趨勢。更具體地說，本專利技術提供了一種具有如下通式Ⅰ的新型胰島素衍生物A鏈 其中X′是人胰島素的氨基酸殘基，它們的網格功能使分子在中性pH值時具有與人胰島素相同的電荷，或比人胰島素的電荷更大的負電荷，但條件是在胰島素分子中相應的位置上至少有一個X與人胰島素的氨基酸殘基不同，並且在A(8)位的X是His或Phe，在A(21)位的X是Asp，在B(5)位的X是Ala，在B(9)位的X是Leu，在B(10)位的X是是Asn或Leu，在B(12)位的X是Asn或者在B(26)位的X是Ala，並在胰島素分子中相應位置上至少一個剩余的X與人胰島素的氨基酸基不同。此外還需要一個或多個氨基酸殘基可以從A鏈和/或B鏈的N終端和/或C終端去除。至少大部份的氨基酸殘基取代物的親水性要比人胰島素中相應部位上氨基酸基強，最好所有氨基酸殘基取代物的親水性強于相應的人胰島素的氨基酸殘基。關于親水性，可參考C.Froemmel，J.Theor.Biol.111(1984)，247-260(表1)。參照以上式Ⅰ，與人胰島素分子中相應位置上的氨基酸基不同的X最好不要多于7個，最佳為2-4個取代物。最好從Asp、Glu、Ser、Thr、His和Ile中選擇氨基酸取代基，特別是選擇帶有負電荷的氨基酸基，即Asp或/和Glu。該新型人胰島素類似物最好含有Asp和/或Glu，而不是人胰島素的一個或多個羥基氨基酸，也不是人胰島素的一個或多個Glu和Asn。該新型人胰島素類似物進而最好含有Ser和/或Thr，或者Asp和/或Glu，而不是一個或多個具有脂肪性和/或芳香性側鏈的人胰島素氨基酸殘基。該新型人胰島素類似物最好還含有His，而不是一個或多個具有脂肪性和/或芳香性側鏈的人胰島素氨基酸基，也不是一個或多個人胰島素的羥基氨基酸。取代的最佳部位是在B9、B10、B12、B26和B27、尤其是B9、B12和B27，在這些位置上一個取代就足以能降低自身聯合的趨勢，並在給藥后可產生快速作用。在B9位上的取代氨基酸殘基可以從下組中選擇Asp、pro、Glu、Ile、Leu、Val、His、Thr、Gln、Asn、Met、Tyr、Trp和Phe，從Asp、Glu、Gln、Asn和His中選取更好。在B12位上的取代氨基酸基可以從Ile和Thr中選擇。B10位上的氨基酸取代基可由Asp、Arg、Glu、Asn和Gln中選取，B26位取代和B27位上的氨基酸取代基最好是Asp或Glu。為了獲得改善的特性，在胰島素分子的剩余位置中，看來至少需要有兩個取本文檔來自技高網...

【技術保護點】
速效的人胰島素類似物，其特征在于它們具有這樣的形式（式１）Ａ－ｃｈａｉｎ＊＊＊Ｂ－ｃｈａｉｎ其中Ｘ是人胰島素的氨基酸殘基或者是相同或不同的氨基酸殘基取代基，其基本作用是使該分子在ＰＨ值為中性的時候，具有與人胰島素相同或者更大 的負電荷，但須在胰島素分子的相應位置上，至少要有一個Ｘ與人胰島素的氨基酸殘基不同，并且在Ａ（８）位上的Ｘ是Ｈｉｓ，或Ｐｈｅ；在Ａ（２１）位上的Ｘ為Ａｓｐ，在Ｂ（５）位上的Ｘ為Ａｌａ，在Ｂ（９）位上的Ｘ為Ｌｅｕ，在Ｂ（１０）位上的Ｘ為Ａｓｕ或Ｌｅｕ，在Ｂ（１２）位上的Ｘ為Ａｓｎ或者在Ｂ（２６）位上的Ｘ為Ａｌａ，此外，其余的Ｘ中至少有一個Ｘ不同于胰島素分子相應位置上的人胰島素的氨基酸殘基，并且還須有一個或多個氨基酸殘基可以從Ａ和／或Ｂ鏈的Ｎ和／或Ｃ端上除去。

【技術特征摘要】
DK 1985-8-30 3956/85;DK 1985-10-14 4677/851.速效的人胰島素類似物，其特征在于它們具有這樣的形式(式1)其中X是人胰島素的氨基酸殘基或者是相同或不同的氨基酸殘基取代基，其基本作用是使該分子在PH值為中性的時候，具有與人胰島素相同或者更大的負電荷，但須在胰島素分子的相應位置上，至少要有一個X與人胰島素的氨基酸殘基不同，並且在A(8)位上的X是His，或Phe；在A(21)位上的X為Asp，在B(5)位上的X為Ala，在B(9)位上的X為Leu，在B(10)位上的X為Asu或Leu，在B(12)位上的X為Asn或者在B(26)位上的X為Ala，此外，其余的X中至少有一個X不同于胰島素分子相應位置上的人胰島素的氨基酸殘基，并且還須有一個或多個氨基酸殘基可以從A和/或B鏈的N和/或C端上除去。2.根據權利要求1的胰島素類似物，其中的氨基酸殘基取代基比胰島素分子中相應位置上的人胰島素氨基酸殘基更加親水。3.根據權利要求1的人胰島素類似物，其中大約少于7個的X不同于人胰島素中相應位置的氨基酸殘基。4.根據權利要求1的人胰島素類似物，其中的氨基酸取代基從Asp、Glu、Sen、Thr、His、Ile組成的組中選擇。5.根據權利要求1的人胰島素類似物，其中的氨基酸殘基取代基是Asp和/或Glu。6.根據權利要求1的胰島素類似物，其中在B(9)，B(12)或B(27)位上的X至少有一個不同于人胰島素分子中相應位置上的氨基酸殘基。7.根據權利要求1的人胰島素類似物，其中B27位上的X為Glu，B12位上的X為Ile或Tyr，A21位上的X為Asp和B27位上的X為Glu，B9位上的X為Asp，A21位和B9位上的X為Asp而B27位上的X為Glu，A8位上的X為His，B9位上的X為Asp和B27位上的X為Glu，B1...

【專利技術屬性】
技術研發人員：杰斯約根維爾加德布朗格，克杰德諾里斯，莫根斯特里爾翰森，
申請(專利權)人：諾威北歐公司，
類型：發明
國別省市：DK[丹麥]