【技術實現步驟摘要】
本專利技術是1983年5月19日遞交的496186號申請的后續部分。一般地說，本專利技術涉及胚胎植物細胞和組織的培養，更具體地說，本專利技術涉及特別適于維持由離體誘導體細胞組織產生之胚胎的改良培養基以及使用該培養基的方法。人們知道，遺傳工程的最新進展使得植物育種者能夠避免傳統育種技術中固有的作物改良中的耗時太長的問題。然而，因為單細胞和多細胞生物需要以不同的方法去改變全部遺傳信息，所以，應用這些技術仍有困難。對于微生物，一種嘗試就是在細胞水平上去影響改變，并有把握通過連續的細胞傳代使之擴增。對于多細胞生物來說，如植物，在細胞水平上進行遺傳操作是較為有利的，然后使之再生并培養成表達新特性的成熟植物。可通過質粒插入以提供特異改變，或通過原生質體融合以進行大批的遺傳操作，將外來遺傳物質摻入宿主細胞內。使用傳統的植物育種技術，用成熟植物作進一步的遺傳操作可向具有農業意義的品種摻入新的特性。〔Allard，R.W.，Principles of Plant Breeding，John Wiley and Sons，New York，1960;Simmons，N.W.，Principles of Crop Lmprovement，Langman Group.Ltd.London，1972〕。離體培養植物細胞和組織，須將培養物保持在培養基內，由培養基提供營養并維持存活力。常用組織培養基的例子已有過文獻評述〔見Huang，L.和T.Murashige，“Plant Tissue Culture ...
【技術保護點】
一種用于誘導、再生和維持植物體細胞胚胎組織的植物細胞培養基，其特征在于它包括一種含銨離子源的培養基，培養基中還加有選自Ｌ－脯氨酸、Ｌ－丙氨酸、Ｌ－精氨酸、Ｌ－谷氨酰胺、Ｌ－天冬酰胺、Ｌ－絲氨酸、Ｌ－鳥氨酸、Ｌ－谷氨酸及其酰胺、烷基酯和其二肽衍生物的至少一種氨基酸，與沒有加氨基酸的培養基所產生的胚胎相比較，所加入的量足以增加所產生體細胞胚胎的數量和質量。
【技術特征摘要】
US 1985-10-22 790.257。一般說來，用植物細胞和組織培養物產生體細胞胚胎發生的方法是已知的，只須稍加改變即可適用于選定的植物品種。(例如見Plant Tissue CultureMethods and Applications in Agriculture，Thorpe編，(1981);該文相關部分列為本文參考文獻)。例如苜蓿，在Saunclers和Bingham的Regen S品系中可通過常規方法誘導胚胎發生(見“Production of Altalfa Plants from Callus Tissue”，Crop Sci.，12804-808，1972)。利用紫花苜蓿(Medicago Sativa)的栽培品種Regens，它是從Vernal和Saranac品種雜交的第二周期重復選擇中得到的。愈傷組織的產生按下述方法進行;用50%CloroxR對葉柄表面滅菌5分鐘，用水洗滌並涂布于無激素的SH培養平板上，該培養基含有Schenk-Hildebrandt培養基(Schenk，R.U.和A.C.Hildebrandt，文獻同上，(1972))所含的鹽類，維生素及蔗糖。該培養基含有25μMα-亞萘基乙酸、10μM激動素和0.8%(W/V)瓊脂(稱為維持培養基)。從仍未愈傷化的植物離體組織上分離出在上面形成的愈傷組織，並在維持培養基上反復培養。愈傷組織以3周間隔培養，並使之于27℃在間接光照下生長。于再培養后17-24天，從維持培養基的平板上收集3-9克愈傷組織，並轉移至含有50μM2，A-二氯苯氧基乙酸(2，4-D)和5μM激動素(B)的100ml SH溶液內進行誘導。(見Walker，K.A.M.L.wendeln，和E.G.Jaworski，plant sci Lett.1623-30(1979)。將愈傷組織置于500ml搖瓶內于27℃下培養3天，培養是在間接光照下，在100K.P.M.的軌道震動器上進行的。于輕度真空下，在系列柱篩(Fisher Scientific公司)和無菌條件下篩分被誘導的細胞。細胞塊通過不銹鋼篩沉落或被擠過35目(480μm)並被收集在60目(230μm)篩網上。用SH無激素培養液洗滌留在60目篩網上的細胞，每100ml誘導培養體積用500ml洗滌。真空除去洗滌培養液。稱量細胞塊的濕重並將細胞懸浮于無激素的SH培養基內，每毫升懸浮150毫克濕重的細胞。將75mg(0.5ml)的懸浮細胞吸至60mm×15mm培養皿中的大約10ml瓊脂固體培養基上。另外，如將300mg(2ml)再懸浮細胞移入裝在50ml錐形瓶內的8ml無激素的SH液體培養基中，在懸浮培養物中將出現體細胞胚胎發生。胚胎發生培養基含有SH培養基(NH+4等于2.6mM)，還含有3%(W/V)蔗糖，沒有激素。無銨離子培養基是以等量的NaH2PO4代替SH中的NH4H2PO+4制成的。25mM NH+4對照培養基由無銨培養基附加12.5mM(NH4)2SO4組成。通過0.2μm濾膜將所有有機和無機還原氮源除菌，然后加至新近高壓滅菌過的培養基內。每種處理一般用10個重復平板進行培養。園盤用保護膜包裝並保溫21天。懸浮液瓶用塑料泡沫塞住并用Saran Wrap 封口，在100rpm的軌道震動器上保溫14天。保溫于27℃12小時光照下進行，光源為冷白熒光燈管，固體培養物與光源距離為28Cm，懸浮培養物距光源為200Cm。保溫后，用放大10倍的立體顯微鏡計數愈傷組織上的綠色中心，以檢測胚胎發生。用放大10倍的標定目測尺測量胚胎大小。用目測觀察以確定胚胎形狀。在初始培養的第21天將胚胎由氨基酸處理培養基在無菌條件下移入加有25μM赤霉酸和0.25μmα-亞萘基乙酸并用0.8%瓊脂固化的半強度無激素的SH培養基內，以使胚胎轉化為有根和萌芽軸(第一初級葉)的完整植物。1.在含銨培養基中的體細胞胚胎的發生A.豆科植物的體細胞培養。按上面概述的方法培養豆科的代表性植物-苜蓿組織，(紫花苜蓿，RegenS品種)，並根據本發明在含有2.6mM銨的培養基中檢驗體細胞發生。所有蛋白質氨基酸的試驗濃度為1-100mM。從此初始篩分過程中出現兩種反應類型，基于這些結果，進一步用篩分的細胞進行試驗。表2為不包括第一反應類型的氨基酸，發現這些氨基酸與SH-對照培養基(2.6mMNH+4)比較對生長有毒性并抑制胚胎發生。這些氨基包含硫和芳香環的，並且大多是分枝鏈族的。這些氨基酸與SH對照培養基比較，均不刺激胚胎發生，並且都是有毒的，它們的濃度為1或10mM時都抑制生長或引起愈傷組織的褐化。與SH對照比較，初始篩選的第二反應型可刺激胚胎發生或致使胚胎增大(參見表2)。對這些氨基酸作了詳細的濃度依賴性研究，結果示于圖1中。刺激體細胞胚胎形成的氨基酸中最有效的是脯氨酸，比2.6mMNH+4對照產生約多3倍的胚胎，而效力是25mMNH+4-苜蓿(D)中最適銨濃度的兩倍。(見Walker等人的上述文獻)。丙氨酸、精氨酸、谷氨酰胺和賴氨酸的效力較小，但它們刺激胚胎形成接近25mMNH+4的水平。絲氨酸和天冬酰胺與SH對照比較，其刺激胚胎發生的作用較差，但可增大胚胎體積。表2概括了已發現對苜蓿體細胞胚胎發生有刺激作用的氨基酸和其它氮源。值得注意的是，脯氨酸的酯和酰胺形成，如二肽脯氨酰丙氨酸一樣，在刺激胚胎數目和提高質量方面具有很高的活性。有趣的是發現非蛋白氨基酸-鳥氨酸具有活性。表2還原氮源對苜蓿體細胞胚胎發生的影響刺激源銨脯氨酸丙氨酸谷氨酰胺精氨酸天冬酰胺鳥氨酸絲氨酸賴氨酸L-脯氨酰胺L-脯氨酰-L-丙氨酸L-脯氨酸甲基酯使用上述技術，用目測觀察胚胎大小以檢測胚胎質量。數據列于表3中。表3 還原氮處理對體細胞胚胎大小的影響處理 長度 寬度對照(25mMNH+4) 0.805±0.084 0.383±0.019100mML-脯氨酸 1.143±0.081 0.867±0.04630mML-丙氨酸 1.163±0.090 0.744±0.037100mML-丙氨酸 1.192±0.102 0.833±0.04930mML-精氨酸 1.521±0.142 0.663±0.04830mML-谷氨酰胺 1.342±0.122 0.773±0.0513mML-賴氨酸 1.163±0.096 0.652±0.0393mML-天冬酰胺 0.699±0.062 0.446±0.02710mML-天冬酰胺 1.239±0.102 0.610±0.034根據表2和表3中給出的數據，氨基酸添加物在增加胚胎體積中的效力可按下列順序排列精氨酸≥谷氨酰胺＞丙氨酸＞脯氨酸＞NH+4。使用上述技術，觀察了胚胎向帶有根及萌芽軸(第一初級葉)之完整植株的轉化，并將結果列表如下表4 體細胞胚胎向苜蓿小植株的轉化初始處理 有第一初級葉的植株百分數25mMNH+433.3%+4.2100mML-脯氨酸 54.0%+6.450mML-丙氨酸 63.5%+4.430mML-精氨酸 59.0%+6.230mML-谷氨酰胺 67.0%+3.4根據表4的數據，影響胚胎向小植株轉化的添加物的效力順序是谷氨酰胺＞丙氨酸≥精氨酸＞脯氨酸＞NH+4這些數據間的相互關系表明，胚胎體積是胚胎向小植株轉化的一個良好標志，因此也是上述技術產生的胚胎質量的一個良好標志。測定了刺激瓊脂固體培養物和液體懸浮培養物中體細胞胚胎發生的氨基酸的最適加入量。這些數據在下列表5和表6中給出表5 向具有2.6mMNH+4的瓊脂固體培養物加入氨基酸對苜蓿體細胞胚胎發生的刺激作用來源 %最大刺激 濃度范圍 最適濃度(mM) (mM)對照(2.6mMNH+4) 100 - -L-脯氨酸 330 10-300 (100)L-丙氨酸 314 20-150 (75-100)L-谷氨酰胺 175 20-50 (30-40)L-精氨酸 244 5-50 (30-40)L-天冬酰胺 155 0.5-3 (1)L-鳥氨酸 156 1-3 (1-3)L-絲氨酸 160 0.5-2 (1)L-賴氨酸 233 1-10 (3)L-脯氨酰胺 240 30-200 (50-100)L-脯氨酸甲基酯 241 5-25 (10)L-脯氨酰-L-丙氨酸 210 30-200 (50-100)表6 向具有2.6mMNH+4液體懸浮培養物中加入氨基酸對體細胞胚胎發生的刺激作用來源 %最大刺激 濃度范圍(mM) 最適濃度(mM)對照(2.6mMNH+4) 100L-脯氨酸 528 100-300 (100)L-丙氨酸 240 25-200 (50)L-谷氨酰胺 243 5-75 (50)L-精氨酸 168 5-75 (50)L-賴氨酸 180 1-10 (3)B.傘形科植物的體細胞培養使傘形科的代表性植物-芹菜(Apium graveolens，Calmario品種)的種子萌發1-2周。用10%Clorox 的溶液將所得籽苗滅菌20分鐘。除去子葉或胚軸，將其置于含有25μM2，4-D和5μM芐基腺嘌呤的0.8%瓊脂固化的無激素SH培養基上。出現愈傷組織后(3-4周)，將愈傷組織移入含2.5μM2，4-D和0.5μM激動素的SH培養基內。用濾器將熱不穩定性添加物除菌并加入熱培養基內。如需要時，可用改良的括抹裝置取得用于接種的特定量的組織并將其充填至均一體積。隨后在加有1μM毒莠定(Picloram)和0.5μM芐基腺嘌呤的SH培養基上再培養愈傷組織。為進行體細胞胚胎生產，將75mg愈傷組織細胞移入含有經過濾膜除菌的添加物的0.8%瓊脂固化的無激素SH培養基內，并在培養苜蓿體細胞的同樣條件下，24℃保溫18到30天。比較了脯氨酸、丙氨酸和谷氨酰胺等氨基酸處理的胚胎與NH+4對照處理的胚胎。用50mM丙氨酸處理培養物導致比所有其它處理方法有更高的胚胎發生頻率，而且比其它方法處理的培養物有更好的子葉、根和初級葉發育。觀察到所形成的總胚胎數的順序如下20-100mM丙氨酸＞50mM脯氨酸＞25mM谷氨酰胺-N＞25mMNH+4雖然用脯氨酸刺激胚胎發生比用谷氨酰胺更好，但后者可導致更好的籽苗樣胚胎的發育。銨處理的培養物比所有其它的處理發育得較小而且胚胎數較少。谷氨酸以30mM的量單獨加入芹菜再生培養基內時，與25mMNH+4處理的材料相比較，它可刺激芹菜胚胎數目的增加。與NH+4處理的胚胎比較，上述濃度的丙氨酸、脯氨酸、谷氨酰胺和谷氨酸可促進胚胎向小植株的轉化。C.禾本科植物的體細胞培養使用本發明的培養基，進行禾本科的代表性植物-玉米(Zeamays)的體細胞胚胎發生。受精十天后收獲玉米的穗并在無菌條件下從中解剖出未成熟的胚胎。將胚胎置于加有3%蔗糖和5μM2，4-D的N-6礦質鹽培養基(Chu，C.C.，Wang，C.C.，Sun，C.S.，Hsu，C.，Yin，K.C.，Chu.C.Y.，1975.Establishment of an efficient medium for anther Culture of rice through Comparative experiments on the nitrogen Sources Sci.Sin.16659-688)上保溫21天。保溫后檢定有或沒有L-脯氨酸時每個愈傷組織上形成的胚胎團的數目。結果在表7中給出，其中百分反應是287-1165個重復胚胎分離塊的胚胎形成的平均頻數。表7 L-脯氨酸對玉米胚胎愈傷組織形成的影響脯氨酸濃度(mM) %胚胎愈傷組織形成0 15.86 20.612 20.824 20.2作為涉及禾本科植物體細胞胚胎發生的進一步的實例，是依據本發明的實踐增殖水稻品種陸稻(Oryza Sativa)。使陸稻(Oryza Sativa)種子去殼，進行表面消毒并置于加有4%蔗糖、0.26mM色氨酸、5μM2，4-D、1μM激動素、pH6.2，并加有2.5克/升Gelrite作為凝膠形成劑的Murashige和Skoog(MS)鹽類培養基上(Murashige，T.和F.Skoog，1962，見上)。15-21天后用解剖顯微鏡檢測單個種子的胚鱗區上的胚胎形成。表8給出了用和不用L-脯...
【專利技術屬性】
技術研發人員：戴維A斯圖爾特，史蒂文G斯特里克蘭，史蒂文G斯特里克蘭，
申請(專利權)人：植物遺傳學公司，
類型：發明
國別省市：US[美國]
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