載體制造技術

一種新載體，其中至少含有一個啟動子區(qū)，該啟動子區(qū)存在于兩個不同的限制性內切酶切點之間，這兩個位點能產生相同的粘性末端．該載體可以作為多重啟動子的基本形式．用此載體制造多重啟動子，就使由遺傳工程合成更有效的蛋白質成為可能．／／（Ｃ１２Ｎ９／１６Ｃ１２Ｒ１：４２５）（Ｃ１２Ｎ１５／００Ｃ１２Ｒ１：４２５）（*該技術在2005年保護過期，可自由使用*）

【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及一種新穎載體。更為特殊的是，專利技術所涉及的這種載體，其特征是至少含有一個啟動基因區(qū)，此啟動基因區(qū)出現在兩個限制性內切酶斷裂位置之間，而這兩個位置分別地為兩種不同的限制性內切酶所識別，但在斷裂處卻給出了兩個相同的粘性末端。這種啟動基因是一種調節(jié)因子，它控制著由RNA所提供的遺傳信息。其作用相當于是一個被RNA聚合酶所識別的位置，相當于是一個RNA聚合酶聯接的位置，和相當于RNA合成的起始點，在蛋白質的合成中起非常重要的作用。Lac啟動基因、trp啟動基因和β-內酰胺酶啟動基因是人們所熟知的啟動基因，它們在宿主大腸桿菌(Escherichiacoli)中的表型表達具有顯著的功效。在探索一種更有效的啟動基因的研究中，一直在尋找這樣的啟動子并創(chuàng)造了雜種啟動基因。例如，tac啟動基因是由trp啟動基因和Lac啟動基因所組成。這是人們所熟知的雜種啟動基因。對于以酵母為宿主的啟動基因來說，被提到的有PGK啟動基因、ADH啟動基因和phoE啟動基因。在探尋一種更有效的啟動基因中，本專利技術人將研究引導到那些各包括有眾多的系列啟動基因的各種啟動基因中去。研究結果，他們發(fā)現，提供了這樣一種載體，即其上有一個啟動區(qū)，該區(qū)在兩種限制性內切酶分別識別的切點之間，而又在兩個切點上分別形成相同的粘性末端，那么，就能造出一系列的含有眾多啟動子的載體。目前，本專利技術已經完成了。所以，本專利技術所涉及的是這樣的載體，其特征是在兩個限制性內切酶斷裂位置之間至少出現一個啟動基因區(qū)，而這兩個位置分別地為兩種不同的限制性內切酶所識別，而在斷裂處卻給出兩個相同的粘性末端。在附圖中，圖1表示了pDR540和由此衍生得到的pTL1，后者對于多重tac啟動基因來說是一種基本質粒;圖2表示了從pTL1構成多重tac啟動基因的示意圖;圖3表示了多重tac啟動基因的構成示意圖;圖4指出了pYN1的限制性內切酶斷裂位置;圖5表示了pYN1的trp啟動基因/操縱基因區(qū)的，以及圍繞它們的DNA序列;圖6指出了pYN3的trp啟動基因/操縱基因區(qū)內部和周圍的限制性內切酶斷裂位置;圖7指出了pYN4的限制性內切酶斷裂位置;圖8指出了pYN6的限制性內切酶斷裂位置;圖9表示了在pYN6的trp啟動基因/操縱基因區(qū)中的DNA序列;圖10指出了pYN8、pYN9和pYN10的限制性內切酶斷裂位置;圖11表示了pYN20的制備示意圖，pYN20通過SalⅠ和XhoⅠ位置用以制備多重trp啟動基因;圖12指出了從pYN20制備pYN21的示意圖，pYN21起著多重trp啟動基因的基本構成的作用;圖13指出了利用SalⅠ和XhoⅠ位置制備雙重和三重trp啟動基因的示意圖。按本專利技術所述，“具有相同的粘性末端”意味著在限制性內切酶斷裂處出現單股斷裂的那些部分具有相同的堿基序列。例如，BglⅡ判別序列是5′-AGATCT-3′3′-TCTAGA-5′在斷裂處，5′-GATC-3′成為粘性末端。另一方面，BamHⅠ識別序列是5′-GGATCC-3′3′-CCTAGG-5′在斷裂處，5′-GATC-3′成為粘性末端。其他限制性內切酶結合位置是SalⅠ與XhoⅠ和BamHⅠ與BclⅠ，這些結合位置也給出相同的粘性末端。上述事實使兩端可能發(fā)生連接(以下稱為“連接”-Ligation)。此連接位置不可能再被前邊所用的兩種酶所斷裂，這是因為這兩個酶的識別位置之間有差別。利用這一特性，就可能制備多重啟動基因。例如，BamHⅠ和BglⅡ粘性末端彼此連接時，就得到下面的序列。5′-GGATCT-3′3′-CCTAGA-5′這樣，在這一MboⅠ斷裂位置上不再能夠用BamHⅠ或BglⅡ斷裂了。SalⅠ和XhoⅠ粘性末端彼此連接時，就得到下面的序列。5′-GTCGAG-3′3′-CAGCTC-5′這一序列是TaqⅠ斷裂位置，所以不再能夠被SalⅠ或XhoⅠ斷裂了。根據本專利技術，一個操縱基因和一個SD序列可以與兩個不同的限制性內切酶的識別位置之間的啟動基因一起存在。操縱基因區(qū)控制著mRNA的合成，通過與一特定的阻遏物相互作用，使之與鄰近的結構基因相符合。SD序列是一個核糖體連接位置，被置于蛋白質合成起始位置的鄰接位置和上方。根據專利技術所提供的載體能夠起到多重啟動基因的一個基本形式的作用。通過利用所謂的載體來構成多重啟動基因，希望以基因工程來更有效地合成蛋白質成為可能。〔多重啟動基因的合成〕這里所出現的術語“多重的啟動基因”，意思就是眾多的重復出現的相鄰的啟動基因。這里，它可以包括一個操縱基因和一個SD序列。當所述的操縱基因和SD序列未被包括在啟動基因中時，操縱基因和SD序列應存在于多重啟動基因的鄰接位置和下方。按照上述方式連接許多啟動基因，可導致提高mRNA的轉錄效率。trp啟動基因是一種能夠有效地產生多肽的啟動基因。當它變?yōu)槎嘀貢r，能夠給出一種可大大提高產率的啟動基因。曾經提到過具有以下序列的啟動基因作為一種trp啟動基因。 此啟動基因用pDR720(可從PLBiochemica1得到)和pGX112(可從Genex得到)制備。雖然pDR720沒有SD序列，但那些表現遺傳信息所必不可少的基本單元-35區(qū)段、-10區(qū)段，和SD序列可以用pGX112衍生一個復合物來獲得。所述的啟動基因的大小約為70bp，并且能夠容易地被切開以用于外來基因的表現。雜化啟動基因可以高產率地和高可調節(jié)地誘導生產所需要的多肽。例如，可能有一種提到過的tac啟動基因，它是一種介于trp啟動基因和lac啟動基因之間的雜種，并且是介于rrn啟動基因和lac啟動基因之間的雜種啟動基因。tac啟動基因包括了trp啟動基因衍生物-35區(qū)段(RNA聚合酶識別位置)和lac啟動基因衍生的-10區(qū)段(RNA聚合酶連接位置，Prinbnow box)，并且使多肽的生產具有高產率。tac啟動基因也含有l(wèi)ac啟動基因衍生的操縱基因和SD序列，受乳糖阻遏物所控制，并且其優(yōu)點在于可很方便地進行調節(jié)。使這種tac啟動基因多重化后，就能夠得到一種能夠提供很高的多肽產率的，有很高的可調節(jié)性的啟動基因。這樣的多重tac啟動基因可以從pDR540(可從PL Biochemical得到)衍生一個基本載體pTL1來制取。將結構基因插入到這樣獲得的載體上的啟動基因/操縱基因(以下縮寫為P/O)下方的限制性內切酶位置處，并且用插入產物來使宿主發(fā)生轉化，從而所述的基因的表現變?yōu)榭赡芰恕?yōu)先選用的宿主是大腸桿菌(Escherichia coli)。有關本專利技術的載體的例子在下面給以敘述。DNA的酶解和連接進行如下混合所需要的DNA(或幾種INA)和酶(或幾種酶)，并用與反應相適應的緩沖液(酶解反應或連接反應)，以制備50～100微升的反應混合物，反應混合物中DNA的最終濃度約為1微克/微升，使反應進行2小時至過夜。酶的用量是每微克DNA用大約3個單位。反應溫度，當使用T4連接酶時為12～16℃，BclⅠ酶解反應是50℃，SmaⅠ酶解反應是30℃，TaqⅠ酶解反應是65℃，用其它酶反應是37℃。下面是反應緩沖液組成，各自的濃度均10倍于進行反應所需要的在實際使用這些緩沖液時，將它們加于反應體系，在數量上作了10倍的稀釋。10×EcoRⅠ 緩沖液 1.本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種載體，其特征在于，至少有一個啟動基因區(qū)，該區(qū)位于兩個限制性內切酶的切點之間，這兩個位點是被兩種不同的限制性內切酶分別識別，但給出相同的粘性末端。

【技術特征摘要】
1.一種載體，其特征在于，至少有一個啟動基因區(qū)，該區(qū)位于兩個限制性內切酶的切點之間，這兩個位點是被兩種不同的限制性內切酶分別識別，但給出相同的粘性末端。2.一種根據權項1所述的載體，其特征在于，所述的兩種不同的限制性內切酶是Bgl Ⅱ和Bam HⅠ。3.根據權項1或2所述的載體，其特征在于，在Bgl Ⅱ和Bam HⅠ切點上方出現一個Eco RⅠ切點。4.根據權項1所述的載體，其特征在于，所述的兩種不同的限制性內切酶是Sal Ⅰ和Xho Ⅰ。5.根據權項1或4所述的載體，其特征在于，在Sal Ⅰ和Xho Ⅰ切點上方出現一個Eco RⅠ切點。6.根據權項1所述的載體，其特征在于，一個操縱子區(qū)和一個SD(Shjne-Dalgarno)序列是被包含在兩個或更多個不同切點之間的。7.根據權項1所述的載體，其特征在于，所述的載體為質粒。8.根據權項1所述的載體，其特征在于，大腸桿菌...

【專利技術屬性】
技術研發(fā)人員：中川幸光，宇野修正，永井正德，有村博文，
申請(專利權)人：綠十字株式會社，
類型：發(fā)明
國別省市：JP[日本]