一種分離獲得植物內生菌的方法技術

本發明專利技術提供了一種分離獲得植物內生菌的方法，是經過植物預處理、表面消毒、內生菌的浸出、內生菌的分離純化等步驟，本發明專利技術方法與一般方法相比，不僅僅利用機械研磨和剪切力使植物內生菌浸出，同時加入表面活性劑和纖維素酶分解植物纖維及植物細胞壁，使植物組織中的內生菌更加充分釋放出來，獲得更好的植物內生菌分離效果。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術屬于微生物學領域，涉及一種從植物中全面分離獲得植物內生菌的方法
技術介紹
植物內生菌廣泛存在于各種植物中，他們對宿主的生命活動產生了巨大的影響，目前 植物內生菌的研究正成為國際上生物、環境、化學等領域的熱點。現有所公布的植物內生 菌分離方法200710065724主要是利用機械力研磨離心的方法從植物組織勻獎中將植物內 生菌分離出來。然而，在離心的過程中，很多內生菌可能仍然存在植物組織中未被分離。 而植物內生菌的研究迫切希望盡可能獲得植物宿主體內所有的內生菌，而本專利技術使用的方 法則能最大限度的獲得植物宿主體內全部內生菌。
技術實現思路
本專利技術的目的在于提供，以期盡可能獲得植物宿主體 內所有的內生菌。本專利技術的目的是通過以下方式實現的。，是經過植物預處理、表面消毒、內生菌的浸出、內生菌的分離純化四步，所述的內生菌的浸出過程為經表面消毒后的根、莖、葉小段分別在無菌條件下于纖維素酶濃度為40—60 ix g/mL， 0.15—0.3% SDS的8 —12mL滅菌PBS溶 液中充分研磨，將研磨液轉入50mL錐型瓶中25—35"C條件下120—180rpm振蕩50— 卯min，得上清液和植物殘渣。內生菌的最佳浸出過程為經表面消毒后的根、莖、葉小段分別在無菌條件下于纖維 素酶濃度為50 U g/mL， 0.25% SDS的10mL滅菌PBS溶液中充分研磨，將研磨液轉入50mL 錐型瓶中30。C條件下150rpm振蕩60min，得上清液和植物殘渣。所述的植物預處理過程為將采集好的新鮮植物用清水洗凈并將其根、莖、葉切成2 厘米左右的小段。所述的表面消毒過程為在70%乙醇與2%次氯酸鈉溶液中浸泡進行表面消毒，浸泡 后用無菌水沖洗5次以去除殘余表面消毒液。所述的內生菌的分離純化過程為在無菌條件下將內生菌的浸出過程中所得上清液、10倍和100倍稀釋上清液各100 u L分別涂布TSB瓊脂平板；將植物殘渣直接印記至TSB瓊脂平板上，所有平板均于30'C恒溫培養2 14天后挑取不同形態的菌落，真菌至査氏培 養基，細菌至TSB固體培養基中，劃線培養至純后于-8(TC保存。 本專利技術的具體過程為1、 植物預處理將采集好的新鮮植物用清水洗凈并將其根、莖、葉切成2厘米左右的小段，2、 表面消毒通過在70%乙醇與2%次氯酸納溶液中的浸泡進行表面消毒，浸泡后用無菌水沖洗5 次以去除殘余表面消毒液，并取100 tx L最后一次洗液涂布平板于3(TC下恒溫培養3天作 為表面消毒的對照，若對照平板無菌落形成則證明表面消毒充分，后續步驟所分離獲得的 均為植物內生菌。表面消毒液的浸泡時間為獲得充分表面消毒效果的最短時間。 一般說來， 植物的根莖表面消毒的時間要長于葉部。3、 內生菌的浸出經表面消毒后的根、莖、葉小段分別在無菌條件下于纖維素酶濃度為40—60yg/mL， 0.15—0.3% SDS的8 — 12mL滅菌PBS溶液中充分研磨，將研磨液轉入50mL錐型瓶中120 一180rpm， 25—35。C條件下保持50—90min，取上清液。在利用機械剪切力使植物內生菌 浸出的基礎上利用表面活性劑與纖維素酶能分解植物纖維及植物細胞壁，使植物組織中的 內生菌充分釋放出來，以獲得更好的植物內生菌分離效果。4、 內生菌的分離純化在無菌條件下一方面將經步驟3的上清液作梯度稀釋，分別取原液、10倍、100倍稀 釋液100ixL涂布TSB瓊脂平板；另一方面，將植物殘渣直接印記至TSB瓊脂平板上，所 有平板均于3(TC恒溫培養2~14天后挑取不同形態的菌落，真菌至査氏培養基，細菌至TSB 固體培養基中，劃線培養至純后于-80。C保存。本專利技術的有益效果本專利技術方法與一般方法相比，不僅僅利用機械研磨和剪切力使植物內生菌浸出，同時 加入表面活性劑和纖維素酶分解植物纖維及植物細胞壁，使植物組織中的內生菌更加充分 釋放出來，獲得更好的植物內生菌分離效果。對于植物內生菌的研究來說所得出的結論科學與否的根本在于是否能分離獲得植物 體內所有的內生菌。因此，盡可能全面的分離獲得植物內生菌是全面研究植物內生菌的根 本。利用本專利技術方法分離植物內生菌效果比一般分離方法效果顯著得多，因此，本專利技術是 研究植物內生菌的優良方法。附圖說明圖1為一般分離法分離內生菌流程圖； 圖2為本專利技術方法分離內生菌流程圖。 具體實施例方式以下實施方式和實施例旨在進一步說明本專利技術，而不是對本專利技術的限定。 實施例1采用兩種方法分別分離龍葵、齒果草、螞蝗七、水雞仔四種植物中的內生菌；采用一 般分離法分離內生菌流程如圖1所示；采用本專利技術方法分離內生菌流程如圖2所示。隨后，將分別經過上述兩種方法獲得的平板經3(TC恒溫培養2~14天后挑取不同形態 的菌落，真菌至查氏培養基，細菌至TSB固體培養基中，劃線培養至純，統計結果如下表所示:根內生菌數莖內生菌數葉內生菌數龍葵內生菌總數未采用本專利技術方法71123采用本專利技術方法34362797根內生菌數莖內生菌數葉內生菌數齒果草內生菌總數未采用本專利技術方法85821采用本專利技術方法28122767根內生菌數莖內生菌數葉內生菌數螞蝗七內生菌總數未采用本專利技術方法94316采用本專利技術方法35282083根內生菌數莖內生菌數葉內生菌數水雞仔內生菌總數未采用本專利技術方法106420采用本專利技術方法312315695由結果可見采用本專利技術方法分離四種內生菌總數明顯比未采用本專利技術方法分離得到 的內生菌總數要多3 5倍；采用本專利技術方法能最大限度的分離獲得植物體內的內生菌。本 專利技術方法效果顯著是一種分離獲得植物體內生菌的優良方法。權利要求1、，是經過植物預處理、表面消毒、內生菌的浸出、內生菌的分離純化四步，其特征在于所述的內生菌的浸出過程為經表面消毒后的根、莖、葉小段分別在無菌條件下于纖維素酶濃度為40—60μg/mL，0.15—0.3％SDS的8—12mL滅菌PBS溶液中充分研磨，將研磨液轉入50mL錐型瓶中25—35℃條件下120—180rpm振蕩50—90min，得上清液和植物殘渣。2、 根據權利要求1所述的，其特征在于，所述的內 生菌的浸出過程為經表面消毒后的根、莖、葉小段分別在無菌條件下于纖維素酶濃度為 50y g/mL， 0.25% SDS的10mL滅菌PBS溶液中充分研磨，將研磨液轉入50mL錐型瓶中 3(TC條件下150rpm振蕩60min，得上清液和植物殘渣。3、 根據權利要求1或2 —種分離獲得植物內生菌的方法，其特征在于，所述的植物 預處理過程為將采集好的新鮮植物用清水洗凈并將其根、莖、葉切成2厘米左右的小段。4、 根據權利要求3 —種分離獲得植物內生菌的方法，其特征在于，所述的表面消毒 過程為在70%乙醇與2%次氯酸鈉溶液中浸泡進行表面消毒，浸泡后用無菌水沖洗5次 以去除殘余表面消毒液。5、 根據權利要求4 ，其特征在于，所述的內生菌的 分離純化過程為在無菌條件下將內生菌的浸出過程中所得上清液、IO倍和IOO倍稀釋上 清液各100uL分別涂布TSB瓊脂平板；將植物殘渣直接印記至TSB瓊脂平板上，所有平 板均于3(TC恒溫培養2 14天后挑取不同形態的菌落，真菌至查氏培養基，細菌至TSB固 體培養基中，劃線培養至純后于-80'C保存。全文摘要本專利技術提供了，是經過植物預處理、本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種分離獲得植物內生菌的方法，是經過植物預處理、表面消毒、內生菌的浸出、內生菌的分離純化四步，其特征在于：所述的內生菌的浸出過程為：經表面消毒后的根、莖、葉小段分別在無菌條件下于纖維素酶濃度為４０－６０μｇ／ｍＬ，０．１５－０．３％ＳＤＳ的８－１２ｍＬ滅菌ＰＢＳ溶液中充分研磨，將研磨液轉入５０ｍＬ錐型瓶中２５－３５℃條件下１２０－１８０ｒｐｍ振蕩５０－９０ｍｉｎ，得上清液和植物殘渣。

【技術特征摘要】

【專利技術屬性】
技術研發人員：羅勝聯，肖瀟，萬勇，陳亮，郭函君，曹喆，蘇峰，
申請(專利權)人：湖南大學，
類型：發明
國別省市：43[中國|湖南]