一種制備豬α-干擾素的方法技術

本發明專利技術提供一種制備豬α－干擾素的方法，通過目的基因克隆、構建芽孢桿菌表達載體、克隆啟動子和信號肽序列并研究其對外源基因表達和分泌的影響，從而構建高效分泌型芽孢桿菌表達系統。通過改進豬α－干擾素基因工程菌發酵條件，提高其表達量；在復性液中添加與鹽酸胍有相似結構的精氨酸，促進蛋白質溶解，不影響蛋白質活性，來提高豬α－干擾素的比活性，從而生產出具有高效、價廉、安全、無潛在病毒污染、穩定性高、單位體積活性效價高等優點的豬α－干擾素，本發明專利技術設計合理，適于工業化生產。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術屬于基因工程
，涉及用高分泌型枯草芽孢桿菌表達系統制 備豬a-干擾素的方法。
技術介紹
干擾素(IFN)是一種廣譜抗病毒劑，并不直接殺傷或抑制病毒，而 主要是通過細胞表面受體作用使細胞產生抗病毒蛋白，從而抑制病毒的復 制；同時還可增強自然殺傷細胞(NK細胞)、巨噬細胞和T淋巴細胞的 活力，從而起到免疫調節作用，并增強抗病毒能力，替代部分抗生素的使 用。1966—1971年，Friedman發現了干擾素的抗病毒機制，而后，千擾 素的免疫調控及抗病毒作用、抗增殖作用以及抗腫瘤作用逐漸被人們認 識。豬ot-干擾素基因有2個亞型，至少有17個亞種，定位于豬的l號染 色體上，目前只有部分被測序和表達。豬a-干擾素是由10多個相關功能基因編碼的蛋白質家族，與豬-co干 擾素亞型之間有高度的同源性。豬a-干擾素的全基因為570bp，編碼189 個氨基酸，其中誘導分泌表達的信號肽由23個氨基酸組成，豬a-干擾素 無內含子。早在1986年，Lefevre等得到了一個含a-干擾素基因的片段， 序列分析表明其中有一連續的含190個密碼子的開放閱讀框，起始密碼子 上游有約IOO個核苷酸的5'區域，具TATTTAA序列，被認為是經修飾 的HognessGoldberg盒。此基因編碼的成熟豬a-干擾素的70-80位氨基酸 有一個潛在的N-糖基化位點。此基因與人IFN-al核苷酸的編碼序列有 78.5。/。同源，編碼的氨基酸與人IFN-al有64M同源，是所有已知動物IFN-(x 基因中與人類IFN-a基因同源性最高的。隨著豬干擾素基因的克隆成功， 對其重組產物的臨床應用及作用機理的研究也隨之展開。1990年，Lefevre 等人在大腸桿菌中表達了 IFN-a基因，得到了一個含189個氨基酸的前體 蛋白，去除其N端的含23個氨基酸的信號肽后，得到了具有完全天然 IFN-a生物學活性的產物，并且其在豬源性細胞上的抗病毒活性至少是病 毒刺激豬白細胞產生的干擾素的6倍。重組豬a-干擾素的抗病毒能力是后續研究的一個熱點，如對偽狂犬病毒(Jan et al,1991)、水泡性口膜炎 病毒、流感病毒(Horisberger，1992)、傳染性胃腸炎病毒(Jordan et al,1994)、 豬呼吸與繁殖綜合癥病毒(Albina et al， 1998)和口蹄疫病毒(Chinsangaram et al,2001)等。國內對豬(x-干擾素的研究也比較早，劉萬鈞等(1998 )用 Vero傳代細胞對豬流行性腹瀉病毒(PEDV)進行干擾試驗，證明豬白細胞 干擾素能有效地抑制PEDV的繁殖活性，在IFN劑量為100U/ml時可明 顯抑制，1000U/ml可顯著抑制，2500U/ml幾乎可完全抑制。其它研究人 員對豬-a干擾素基因進行了克隆和表達，并獲得了具有抗病毒活性重組 蛋白，陳濤(2002)將克隆的豬a-干擾素基因進行了定點突變，第86位 的CyS突變為Tyr，同時將N端首位氨基酸(CyS)的密碼子TGT同義突變 為大腸桿菌偏愛的密碼子TGC，并將在大腸桿菌BL21中表達，獲得的重 組蛋白比未突變的重組蛋白抗病毒能力有所提高。謝海燕等(2004)在大 腸桿菌BL21 (DE3)中對豬a-干擾素進行了融合表達，經western-blotting 檢測，重組融合蛋白具有良好的反應源性；豬干擾素是一類具有抗病毒和 免疫調節活性的細胞因子，是豬體抵御病原入侵的重要早期防御系統之 一。應用基因工程的方法通過大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、酵母和哺乳動物 細胞表達系統等表達的重組豬干擾素可以具有與天然干擾素高度相似甚 至更高的抗病毒等生物學活性。因此，作為一類具有高效的抗病毒和免疫 調節作用的生物制劑，重組豬a-干擾素在養豬業有廣泛的應用前景。1980-1982年，科學家用基因工程方法在大腸桿菌及酵母菌細胞內獲 得了干擾素，從每1升細胞培養物中可以得到20-40毫升干擾素。從1987 年開始，使用基因工程方法生產干擾素。但目前的豬a-干擾素存在著穩定 性差、產品活性低等難題。
技術實現思路
本專利技術的目的在于提供一種制備豬a-干擾素的方法，通過以下技術方案實現(1)設計一對在大腸桿菌中表達豬a-干擾素成熟肽基因的表達引物，克隆豬 a-干擾素成熟肽基因，得到重組質粒；SEQNOh 5Eifn5，-TAGAATTCTGCAACCTGCCTCAGACCCA-3'SEQ NO 2: 3Eifn5，-GCGGCCGCTCACTCCTTCTTCCTGAGTCTGTCT-3'胸I豬a-干擾素基因序列見SEQ NO 3。(2) 載體構建將重組質粒和表達載體用五COl和^"I進行雙酶切，回收酶切片段，與表達載體連接，轉化，篩選陽性質粒，然后進行PCR和酶切 鑒定；(3) 豬a-干擾素在枯草芽孢桿菌中的表達制備芽孢桿菌感受態細胞， 將重組質粒經過點擊轉化導入其中，作進一步培養，并抽提質粒后進行和^d雙酶切檢驗；(4) 重組工程菌的蛋白電泳菌液上清進行濃縮，用銀染對SDS-PAGE 進行染色；(5) 豬a-干擾素標的產物產量和活性的研究；(6) 菌種制備將豬a-干擾素基因工程菌菌株接種到含氨芐青霉素鈉的 LB液體培養基中培養，將菌液接種于發酵罐中，溫度3(TC， pH為7.0，攪拌速 度200-220rpm，培養6小時后增溫至45"C誘導，豬a-干擾素開始表達，至28小時 表達量達到最大值，在此期間質粒穩定性良好；(7) 獲得產品離心收集菌體，用緩沖液沖洗菌體，冰浴超聲破碎，取 上清液，收集包涵體沉淀，用洗滌液洗滌，取上清液，加入復性液，調節pH 用復性液透析，取上清液濃縮；(8) 產品純化利用DEAE陰離子交換纖維柱梯度洗脫，收集含豬a-干擾 素的洗脫液，超濾濃縮，得到產品。本專利技術提供的方法，不僅提高豬a-干擾素的穩定性，降低其生產成本， 提高其生產效率，而且能提高豬a-干擾素的單位體積的活性。具體體現在(1) 構建的載體整合到芽孢桿菌中，十分穩定，不易丟失。(2) 發酵初期采用不含甲醇的LB培養基，培養后期采用1.0%甲醇誘導 培養基培養，使芽孢桿菌的生長和蛋白表達有效分開，從而使得干擾素表達量 可維持在較高的水平，不易分解。(3) 本專利技術是一種用高分泌型枯草芽孢桿菌表達系統生產豬a -干擾素的 新工藝，這種新工藝通過目的基因克隆、構建芽孢桿菌表達載體、克隆啟動子 和信號肽序列并研究其對外源基因表達和分泌的影響，從而構建構建高效分泌 型芽孢桿菌表達系統。通過改進豬a-干擾素基因工程菌發酵條件，提高其表 達量；在復性液中添加與鹽酸胍有相似結構的精氨酸，促進蛋白質溶解，不影 響蛋白質活性，來提高豬a-干擾素的比活性。從而生產出具有高效、價廉、安全、無潛在病毒污染、穩定性高、單位體積活性效價高等優點的豬C-干擾 素，這為工業化生產豬a-干擾素，并應用于我國的養豬事業奠定了基礎。附圖說明圖1為基因克隆示意圖。圖2為豬a干擾素基因PCR擴增電泳。 圖3為豬a-干擾素基因在枯草芽孢桿菌中的表達。 圖4為含有限制性酶切位點Sa/I和^^1的PoIFN基因擴增。 圖5為枯草桿菌陽性表達子的雙酶切產物電泳。 圖6為豬a-干擾素基因在枯草桿菌中表達產物的蛋白質電泳。 具體實施例本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種制備豬α－干擾素的方法，通過以下技術方案實現：　（１）設計一對在大腸桿菌中表達豬α－干擾素成熟肽基因的表達引物，在上、下游引物的５’端分別引入ＥｃｏＲＩ和ＮｏｔＩ酶切位點序列；　（２）載體構建：將重組質粒和表達載體用ＥｃｏＩ 和ＸｂａＩ進行雙酶切，回收酶切片段，與表達載體連接，轉化，篩選陽性質粒，然后進行ＰＣＲ和酶切鑒定；　（３）豬α－干擾素在枯草芽孢桿菌中的表達：制備芽孢桿菌感受態細胞，將重組質粒經過點擊轉化導入其中，作進一步培養，并抽提質粒后進行Ｓａｌ Ｉ和ＸｂａＩ雙酶切檢驗；　（４）重組工程菌的蛋白電泳：菌液上清進行濃縮，用銀染對ＳＤＳ－ＰＡＧＥ進行染色；　（５）豬α－干擾素標的產物產量和活性的研究；　（６）菌種制備：將豬α－干擾素基因工程菌菌株接種到含氨芐青霉素鈉的Ｌ Ｂ液體培養基中培養，將菌液接種于發酵罐中，溫度３０℃，ｐＨ為７．０，攪拌速度２００－２２０ｒｐｍ，培養６小時后增溫至４５℃誘導，豬α－干擾素開始表達，至２８小時表達量達到最大值，在此期間質粒穩定性良好；　（７）獲得產品：離心收集菌體， 用緩沖液沖洗菌體，冰浴超聲破碎，取上清液，收集包涵體沉淀，用洗滌液洗滌，取上清液，加入復性液，調節ｐＨ用復性液透析，取上清液濃縮；　（８）產品純化：利用ＤＥＡＥ陰離子交換纖維柱梯度洗脫，收集含豬α－干擾素的洗脫液，超濾濃縮，得到產品。...

【技術特征摘要】

【專利技術屬性】
技術研發人員：余東游，姜禮輝，劉韶娜，陳偉東，
申請(專利權)人：浙江大學，杭州萬得富生物技術有限公司，
類型：發明
國別省市：86[中國|杭州]