生產乳過氧化物酶的方法技術

本發明專利技術涉及生產乳過氧化物酶的方法，其包括如下步驟：（１）將原料乳與具有弱酸性基團作為離子交換基團的陽離子交換劑接觸，由此實現吸附處理；（２）洗滌吸附處理之后的陽離子交換劑；（３）洗滌后將該陽離子交換劑與浸出溶劑接觸，由此得到乳過氧化物酶溶出至浸出溶劑的浸出溶液；（４）通過超濾膜濃縮浸出溶液，由此實現在濃縮的浸出溶液中的沉積；和（５）通過從濃縮的浸出溶液中去除沉積物得到乳過氧化物酶溶液。

【技術實現步驟摘要】
【國外來華專利技術】
本專利技術涉及從乳原料生產高純度乳過氧化物酶(lactoperoxidase)的方法。本專利技術要求2004年2月17日提交的日本專利申請No.2004-039704的優先權，其內容并入本文作為參考。
技術介紹
乳過氧化物酶是一種氧化還原酶，其包含在哺乳動物乳液如牛乳，和其它分泌物如唾液(saliva)、淚液(lacrymal fluid)和呼吸道粘液(respiratory tractmucus)中(例如，American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine，U.S.A.Vol.166，2002，p.S57至S61)。乳過氧化物酶是分子量約80,000的蛋白質。乳過氧化物酶具有血紅素(heme)作為每一個分子的輔酶。由于此血紅素的最大吸收波長(maximum absorption wavelength)為大約412nm，高度純化的乳過氧化物酶顯褐色(例如，British Journal of Nutrition，England，Vol.84，2000，p.S19至S25)。據報道，乳過氧化物酶具有各種生物學功能諸如抗細菌性質(antibacterialproperty)、抗病毒活性(antiviral activity)、抗氧化活性(antioxidative activity)、抗癌活性(anticancer activity)和免疫調節活性(immunoregulatory activity)(例如，所述的British Journal of Nutrition，England，Vol.84，2000，p.S19至S25和Life Sciences，England，Vol.43，1988，p.739至745)，而且已顯示這是一種與宿主防御(host defense)有關的非常重要的蛋白質。關于所述乳過氧化物酶的工業應用，有公開的技術如乳過氧化物酶、過氧化物供體和硫氰酸鹽(thiocyanate)在制造治療幽門螺旋桿菌(helicobacter pylori)感染的藥物中的用途(例如，PCT公開的日文文本No.2000-509367)；加入培養的水生動物的配合飼料中的病原菌傳染病預防和治療劑(例如，日本專利No.3103615)；老化預防劑(例如，日本專利No.3103167)；肝功能改善劑(hepatic function ameliorative agent)(例如，未審查的日本專利申請，第一次公開No.2001-226289)，過氧化物酶的預防和治療應用(例如，PCT公開的日文文本No.H06-501453)；和用于角膜疾病的治療劑(例如，日本專利No.2840795)。此外，有本專利技術人公開的技術如脲酶-失活組合物和飲料(例如，未審查的日本專利申請，第一次公開No.2002-238554)，和腸內菌叢(intestinal flora)改進劑和食品和飲料(例如，未審查的日本專利申請，第一次公開No.2003-246753)。在Acta Chemica Scandinavica，Denmark，Vol.23，1969，p.171至184；FEBSLetters，Holland，Vol.110，1980，p.200至204；和Journal of Chromatography，Holland，Vol.795，1998，p.277至287中報道了以實驗室規模純化過氧化物酶的方法。作為其通常方法，有如下已知方法將酸如氫氯酸加入乳，進行等電點沉淀酪蛋白，以便于制備作為上清液的乳清；將得到的乳清與陽離子交換劑接觸，以將乳清中帶正電荷的乳過氧化物酶吸附到該陽離子交換劑中；接著，用低鹽緩沖溶液洗滌此陽離子交換劑，然后用高鹽緩沖溶液將乳過氧化物酶解吸。在實驗室規模的純化方法中，為了改進乳過氧化物酶純度，通常使用如下方法使用以具有小直徑粒子的凝膠形式的陽離子交換劑高密度填充的柱子，和用高壓泵實施高速通過(例如，Journal of Chromatography，Holland，Vol.795，1998，p.277至287)。在另一方面，如果用具有相對大直徑粒子的陽離子交換劑填充柱子，并通過自然滴落而不用高壓泵實施通過，則花費較多的時間(例如，Acta ChemicaScandinavica，Denmark，Vol.23，1969，p.171至184，和FEBS Letters，Holland，Vol.110，1980，p.200至204)。連同工業規模的分離技術中近來的進展，可能分離并純化包含在乳中的高純度生物活性物質用于大規模生產(mass production)。在大多數情況中，實際上難以將在實驗室規模優化的蛋白質純化方法按照原樣放大到工業規模。一個主要的原因是實驗室中通常使用的離子交換劑或柱的性能不是必然適于原材料的大規模處理。此外，由于將添加劑加入乳原料易于改變乳的味道和物理性質，因此使用添加劑來從乳原料中純化蛋白不是優選的。此外，如果使用大量的添加劑以洗滌陽離子交換劑和/或從該陽離子交換劑解吸蛋白質，那么需要從純化的蛋白質中去除這些添加劑，因而生產過程變得復雜。作為在從乳原料生產高純度蛋白質中解決這些問題的生產方法，本申請人已提出了用于生產高純度牛乳鐵蛋白的方法(例如，已審查的日本專利申請，第二次公開No.H06-13560)關于乳過氧化物酶的工業生產方法，公開了如下方法在美國專利No.4667018的說明書中，公開了用于從乳或其乳衍生物中純化蛋白如乳鐵蛋白和乳過氧化物酶的方法。在此方法中，公開了如下方法將乳或其乳衍生物與包含陽離子多糖的陽離子交換劑接觸；用低鹽溶液洗滌該陽離子交換劑；然后用高鹽溶液從陽離子交換劑解吸蛋白質。然而，由于在此專利文獻中描述的方法中產生的蛋白質以混合物獲得，所以純度不高，而且存在不能生產高純度乳過氧化物酶的問題。在日本專利No.2985158中，公開了回收具有高活性的乳烴素級分(lactenin fraction)的方法。在此專利文獻描述的此方法中，由于乳過氧化物酶作為構成乳烴素的一種組分獲得，并包含在蛋白質混合物中，所以也存在不能生產高純度乳過氧化物酶的問題。在歐洲專利No.0518448的說明書中，作為從乳中分離蛋白質的方法，公開了使用金屬螯合物載體(metal chelate carrier)的方法。在此方法中，由于分離的蛋白質是包含免疫球蛋白、乳鐵蛋白和乳過氧化物酶的混合物，所以存在不能生產高純度乳過氧化物酶的問題。在日本專利No.3403066中，公開了從乳或乳衍生物中回收細胞增殖因子或含有一種或多種類型的細胞增殖因子的組合物的方法。然而，由于在此方法中得到的組合物是混合物，因此也存在該方法不能生產高純度乳過氧化物酶的問題。在日本專利No.2710283中，作為從乳清(whey)中選擇性提取金屬蛋白的方法，公開了包括以下步驟的方法將乳清與用含有羧基或磺酸基的葡聚糖涂覆的無機多孔粒子(二氧化硅粒子)接觸。此方法中生產的乳過氧化物酶的純度最高為大約50％，并且存在的問題是為了產生高純度乳過氧化物酶，需要通過另一個步驟增加純度。在日本專利No.2553180中，公開了從乳清中提取乳過氧化物酶和本文檔來自技高網...

【技術保護點】
生產乳過氧化物酶的方法，其包括：步驟（１）將一種或多種乳原料與具有弱酸性基團作為離子交換基團的陽離子交換劑接觸由此實現吸附處理；步驟（２）洗滌所述吸附處理之后的陽離子交換劑；步驟（３）將所述洗滌的陽離子交換劑與洗脫乳過氧化物酶的浸出溶劑接觸，由此得到乳過氧化物酶洗脫至所述浸出溶劑的浸出溶液；步驟（４）通過超濾膜濃縮所述浸出溶液，由此實現在濃縮的浸出溶液中的沉淀；和步驟（５）通過從所述濃縮的浸出溶液中去除沉淀得到乳過氧化物酶溶液。

【技術特征摘要】
【國外來華專利技術】...

【專利技術屬性】
技術研發人員：市橋信夫，山內恒治，新光一郎，安藤哲也，
申請(專利權)人：森永乳業株式會社，
類型：發明
國別省市：JP[日本]