產生自然殺傷細胞的方法、由此獲得的細胞群體及其用途技術

本文提供了使用兩步擴增和分化方法產生自然殺傷細胞的方法和由此獲得的激活的NK細胞群體。本文還提供了抑制腫瘤細胞增殖、治療患有癌或病毒感染的個體的方法，包括將通過所述方法產生的NK細胞施用給患有癌或病毒感染的個體。

The method of producing natural killer cells, the resulting cell population and its use

This article provides a method of using two step amplification and differentiation to produce natural killer cells and the resulting activated NK cell population. This article also provides methods to inhibit tumor cell proliferation and treat individuals infected with cancer or virus, including the use of NK cells produced by the method to individuals with cancer or virus infection.

【技術實現(xiàn)步驟摘要】
產生自然殺傷細胞的方法、由此獲得的細胞群體及其用途1.相關申請本申請是申請日為2011年7月13日，申請?zhí)枮?01180043919.3，名稱為“產生自然殺傷細胞的方法”的中國專利技術專利申請的分案申請。本專利技術申請要求2010年7月13日提交的美國臨時專利申請序號No.61/363,981和2011年6月16日提交的美國臨時專利申請序號No.61/497,897的優(yōu)先權，以上專利申請的公開內容以它們的全部內容作為參考并入本文。2.
本文提供了產生自然殺傷細胞群體的方法，例如，來源于胎盤的自然殺傷細胞，例如，來源于胎盤灌洗液(例如，人胎盤灌洗液)，如胎盤源中間體自然殺傷細胞，或者來源于其他組織，例如，臍帶血或外周血。本文還提供了通過本文所提供的方法產生的擴增的自然殺傷細胞群體。本文還提供了使用胎盤灌洗液以及來自所述胎盤灌洗液的自然殺傷細胞抑制腫瘤細胞增殖的方法。在某些實施方式中，將所述自然殺傷細胞與一種或多種免疫調節(jié)化合物(例如，稱為IMiDTM的免疫調節(jié)化合物)組合使用或用所述一種或多種免疫調節(jié)化合物處理。3.
技術介紹
自然殺傷(NK)細胞是構成天然免疫系統(tǒng)的主要部分的細胞毒性淋巴細胞。NK細胞不表達T細胞抗原受體(TCR)、CD3或表面免疫球蛋白(Ig)B細胞受體。NK細胞通常在人中表達表面標志物CD16(FcyRIII)和CD56，但人NK細胞的亞類為CD16。NK細胞是細胞毒性的；它們細胞質中的微粒含有特殊的蛋白質，如穿孔素和被稱為顆粒酶的蛋白酶。一旦在要殺傷的靶細胞附近釋放，則穿孔素在所述靶細胞的細胞膜中形成孔，通過該孔顆粒酶和結合分子可以進入，從而引起細胞凋亡。一種顆粒酶，顆粒酶B(也稱為顆粒酶2和細胞毒性T-淋巴細胞相關絲氨酸酯酶1)，是對于在細胞介導免疫反應中快速引起靶細胞細胞凋亡來說至關重要的絲氨酸蛋白酶。NK細胞對干擾素或者巨噬細胞源細胞因子響應而被激活。激活的NK細胞稱為淋巴因子活化的殺傷(LAK)細胞。NK細胞具有控制細胞的細胞毒活性的兩種表面受體類型(標記為“激活受體”和“抑制受體”)。除了活性，NK細胞在宿主腫瘤排斥中起作用。由于癌細胞的I類MHC表達降低或無表達，因此它們可以成為NK細胞的靶標。積累的臨床數(shù)據(jù)表明分離自外周血單核細胞(PBMC)或骨髓的人NK細胞的單倍同一性移植介導了有效力的抗白血病作用而不會導致可檢測的移植物抗宿主病(GVHD)。參見Ruggeri等人,Science295:2097-2100(2002)。自然殺傷細胞可以通過細胞缺少或顯示出降低水平的主要組織相容性復合體(MHC)蛋白而被激活。另外，已知NK細胞上表達的激活受體介導了具有激活受體表達配體的“應激”或轉化細胞的檢測，并因此引起了NK細胞的激活。例如，NCR1(NKp46)結合病毒血球凝集素。NKG2D配體包含CMVUL16結合蛋白1(ULB1)、ULB2，ULB3和MHCI類多肽相關序列A(MICA)和MICB蛋白。NK蛋白2B4結合CD48，并且DNAM-1結合脊髓灰質炎病毒受體(PVR)和連接素2(Nectin-2)，兩者均在急性骨髓性白血病(AML)中持續(xù)檢測到。參見Penda等人,Blood105:2066-2073(2004)。參見Marrobio等，此外，已說明AML的溶胞主要是自然細胞毒性受體(NCR)依賴性的。參見Fauriat等人,Blood109:323-330(2007)。激活并擴增的來源于外周血的NK細胞和LAK細胞已在晚期癌患者的離體療法和體內治療中使用，并且對骨髓相關疾病，如白血病；乳腺癌；和某些類型的淋巴瘤取得了一定的成功。LAK細胞治療需要患者首先接受IL-2，隨后進行白細胞去除術，然后將收獲的自體同源性血細胞在存在IL-2的情況下培育和培養(yǎng)幾天。必須將LAK細胞與相對高劑量的IL-2一起再輸注以完成所述療法。這種凈化治療(purgingtreatment)是昂貴的并可以導致嚴重的副作用。這些包括體液潴留、肺水腫、血壓降低和高燒。雖然NK細胞在殺死腫瘤細胞和病毒感染細胞中具有有利性能，但是它們仍難以與免疫療法一起使用和在免疫療法中應用，這主要是由于在培養(yǎng)和擴增期間難以維持它們的腫瘤靶向和殺腫瘤能力。因此，在本領域中需要發(fā)展產生和擴增保留殺腫瘤功能的自然殺傷細胞的有效方法。4.
技術實現(xiàn)思路
本文提供了將細胞，例如，造血細胞，如造血干細胞，例如，CD34+造血干細胞，擴增和分化為自然殺傷細胞的方法。在一個方面，本文提供了產生自然殺傷(NK)細胞的方法，包括在第一培養(yǎng)基中培養(yǎng)造血干細胞或祖細胞，例如，CD34+干細胞或祖細胞以產生擴增和分化的細胞，并隨后在其中所述細胞進一步擴增并分化成自然殺傷細胞的第二培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述擴增的細胞。該第一步驟和第二步驟包括在具有細胞因子獨特組合的培養(yǎng)基中培養(yǎng)細胞。在某些實施方式中，所述細胞因子(例如，細胞因子)不包含在培養(yǎng)基不明確的組分(例如，血清)中，例如，細胞因子(例如，細胞因子)對于培養(yǎng)基不明確的組分(例如，血清)來說是外源的。在某些實施方式中，所述方法是兩步法。在某些實施方式中，該方法不包括其中接觸細胞的任何第三步驟或中間步驟。在具體的實施方式中，本文提供了產生激活的自然殺傷(NK)細胞群體的方法，其包括：(a)將造血干細胞或祖細胞群體接種到包含白細胞介素-15(IL-15)并可選地包含干細胞因子(SCF)和白細胞介素-7(IL-7)中的一種或多種的第一培養(yǎng)基中，其中所述IL-15和可選的SCF和IL-7不包含在所述培養(yǎng)基的不明確的組分中，從而所述群體擴增并且所述造血干細胞或祖細胞群體內的多個造血干細胞或祖細胞在所述擴增期間分化為NK細胞；和(b)將來自第一步驟的細胞在包含白細胞介素-2(IL-2)的第二培養(yǎng)基中擴增，以產生激活的NK細胞群體。通過本文所提供的方法(例如，兩步法)產生的自然殺傷細胞在本文中被稱為TSNK細胞。在某些實施方式中，所述第一培養(yǎng)基包括含有人血清(例如，人血清AB)、胎牛血清(FBS)或胎牛血清(FCS)，例如，5％至20％(v/v)；干細胞因子(SCF)，例如，1ng/mL至50ng/mL；FMS樣酪氨酸激酶-3配體(Flt-3配體)，例如，1ng/mL至20ng/mL；白細胞介素-7(IL-7)，例如，1ng/mL至50ng/mL；促血小板生成素(TPO)，例如，1ng/mL與50ng/mL；白細胞介素-2(IL-2)，例如，50IU/mL至500IU/mL；白細胞介素-15(IL-15)，例如，1ng/mL至50ng/mL；和/或肝素，例如，0.1IU/mL至10IU/mL中一種或多種的培養(yǎng)基。在具體的實施方式中，所述第一培養(yǎng)基包含干細胞因子(SCF)、白細胞介素-7(IL-7)和白細胞介素-15(IL-15)。在另一種具體的實施方式中，所述第一培養(yǎng)基包含生長培養(yǎng)基、人血清(例如，人血清AB)、FBS、FCS、SCF、IL-7和IL-15。在另一種具體的實施方式中，所述第一培養(yǎng)基還包含F(xiàn)lt-3配體(Flt3-L)、TPO、IL-2和/或肝素。在另一種具體的實施方式中，所述第一培養(yǎng)基包含生長培養(yǎng)基、10％的人血清或者胎牛血清、20ng/mL的SCF、10ng/mL的Flt3-L、20ng本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術保護點】
一種產生激活的自然殺傷(NK)細胞群體的方法，包括：(a)將造血干細胞或祖細胞群體接種到包含白細胞介素?15(IL?15)并可選地包含干細胞因子(SCF)和白細胞介素?7(IL?7)中的一種或多種的第一培養(yǎng)基中，其中所述IL?15和可選的SCF和IL?7不包含在所述培養(yǎng)基的不明確的組分中，從而所述群體擴增并且所述造血干細胞或祖細胞群體內的多個造血干細胞或祖細胞在所述擴增期間分化為NK細胞；和(b)將來自步驟(a)的所述細胞在包含干擾白細胞素?2(IL?2)的第二培養(yǎng)基中擴增，以產生激活的NK細胞群體。

【技術特征摘要】
2010.07.13 US 61/363,981;2011.06.16 US 61/497,8971.一種產生激活的自然殺傷(NK)細胞群體的方法，包括：(a)將造血干細胞或祖細胞群體接種到包含白細胞介素-15(IL-15)并可選地包含干細胞因子(SCF)和白細胞介素-7(IL-7)中的一種或多種的第一培養(yǎng)基中，其中所述IL-15和可選的SCF和IL-7不包含在所述培養(yǎng)基的不明確的組分中，從而所述群體擴增并且所述造血干細胞或祖細胞群體內的多個造血干細胞或祖細胞在所述擴增期間分化為NK細胞；和(b)將來自步驟(a)的所述細胞在包含干擾白細胞素-2(IL-2)的第二培養(yǎng)基中擴增，以產生激活的NK細胞群體。2.一種產生激活的自然殺傷(NK)細胞群體的兩步法，其中，所述方法的第一步包括在包含干細胞因子(SCF)、白細胞介素-7(IL-7)和白細胞介素-15(IL-15)中的一種或多種的第一培養(yǎng)基中擴增造血干細胞或祖細胞群體，并且其中所述SCF、IL-7和IL-15不包含在所述培養(yǎng)基的不明確的組分中，并且其中所述造血干細胞或祖細胞群體內的多個造血干細胞或祖細胞在所述擴增期間分化為NK細胞；和其中所述方法的第二步包括在包含干擾白細胞素-2(IL-2)的第二培養(yǎng)基中擴增來自所述第一步的細胞，以產生激活的NK細胞。3.根據(jù)權利要求1所述的方法，其中，所述第一培養(yǎng)基還包含F(xiàn)ms樣酪氨酸激酶3配體(Flt3-L)、促血小板生成素(Tpo)、白細胞介素-2(IL-2)或肝素中的一種或多種。4.根據(jù)權利要求3所述的方法，其中，所述第一培養(yǎng)基還包含胎牛血清或人血清。5.根據(jù)權利要求3所述的方法，其中，所述SCF在所述第一培養(yǎng)基中以約1至約150ng/mL的濃度存在。6.根據(jù)權利要求3所述的方法，其中，所述Flt3-L在所述第一培養(yǎng)基中以約1至約150ng/mL的濃度存在。7.根據(jù)權利要求3所述的方法，其中，所述IL-2在所述第一培養(yǎng)基中以約50至約1500IU/mL的濃度存在。8.根據(jù)權利要求3所述的方法，其中，所述IL-7在所述第一培養(yǎng)基中以約1至約150ng/mL的濃度存在。9.根據(jù)權利要求3所述的方法，其中，所述IL-15在所述第一培養(yǎng)基中以約1至約150ng/mL的濃度存在。10.根據(jù)權利要求3所述的方法，其中，所述Tpo在所述第一培養(yǎng)基中以約1至約150ng/mL的濃度存在。11.根據(jù)權利要求3所述的方法，其中，所述肝素在所述第一培養(yǎng)基中以約0.1至...

【專利技術屬性】
技術研發(fā)人員：羅伯特·J·哈黎里，穆罕默德·A·黑德蘭，斯蒂芬·亞什科，康琳，埃里克·勞，阿賈伊·帕爾，芭娃妮·斯托特，瓦內薩·沃斯基納里安貝爾斯，安德魯·查特林，張小葵，
申請(專利權)人：人類起源公司，
類型：發(fā)明
國別省市：美國,US