識(shí)別β－淀粉樣肽的人源化抗體制造技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)提供了改進(jìn)的試劑和方法，用于治療與病人腦中的Ａβ淀粉樣沉積有關(guān)的疾病。優(yōu)選的試劑包括人源化抗體。（*該技術(shù)在2023年保護(hù)過(guò)期，可自由使用*）

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
相關(guān)的申請(qǐng)本申請(qǐng)要求以前在先提交的臨時(shí)專利申請(qǐng)U.S.No.60/363751(2002年3月12日提交)的優(yōu)先權(quán)，該申請(qǐng)的標(biāo)題是“識(shí)別β-淀粉樣肽的人源化抗體”(在審)。上面引用的申請(qǐng)的全部?jī)?nèi)容在此引為參考。
技術(shù)介紹
阿茨海默氏病(AD)是一種進(jìn)行性疾病，可以引起老年癡呆。參見Selkoe，TINS 16403(1993)；Hardy等，WO 92/13069；Selkoe，J.Neuropathol.Exp.Neurol.53438(1994)；Duff等，Nature 373476(1995)；Games等，Nature 373523(1995)。從廣義來(lái)說(shuō)，這種疾病分為兩類在老齡(65歲以上)發(fā)作的晚期發(fā)病型和老年期以前，即35歲到60歲之間就完全發(fā)展的早期發(fā)病型。在這兩種類型的疾病中，病理學(xué)是相同的，但是在較早年齡開始發(fā)病的情況下，異常會(huì)趨于更加嚴(yán)重和廣泛。該病的特點(diǎn)是在腦中至少有兩種類型的損害，神經(jīng)纖維纏結(jié)和老年斑。神經(jīng)纖維纏結(jié)是與tau蛋白相關(guān)的微管的細(xì)胞內(nèi)沉積，該蛋白由兩根成對(duì)的互相纏繞的纖絲組成。老年斑(即淀粉樣斑)是被打亂的神經(jīng)纖維網(wǎng)的區(qū)域，它覆蓋著位于中心的細(xì)胞外淀粉樣沉積物，可達(dá)150μm，在腦組織切片的顯微鏡分析時(shí)可以看到。淀粉樣斑在腦中的積累也與Down氏綜合癥和其它認(rèn)知紊亂有關(guān)。斑的基本組成成分是一種被稱為Aβ或β-淀粉樣肽的肽。Aβ肽是一種被稱為淀粉樣前體蛋白(APP)的較大的跨膜糖蛋白中含有39-43個(gè)氨基酸的內(nèi)部片段，大小約為4-kDa。作為APP被不同的分泌酶進(jìn)行蛋白水解加工的結(jié)果，最初發(fā)現(xiàn)的Aβ有兩種形式，短的形式長(zhǎng)度為40個(gè)氨基酸，而長(zhǎng)的形式長(zhǎng)度為42-43個(gè)氨基酸。在Aβ的羧基端發(fā)現(xiàn)了APP的疏水跨膜結(jié)構(gòu)域的一部分，這可能解釋了Aβ、特別是長(zhǎng)形式的Aβ在斑中聚集的能力。淀粉樣斑在腦中的積累最終導(dǎo)致神經(jīng)元細(xì)胞的死亡。與這種類型的神經(jīng)元退化有關(guān)的生理癥狀是阿茨海默氏病的特點(diǎn)。APP蛋白中的幾個(gè)突變已經(jīng)與阿茨海默氏病的出現(xiàn)相關(guān)聯(lián)。參見例如Goate等，Nature 349704(1991)(717位的纈氨酸變?yōu)楫惲涟彼?；Chartier Harlan等，Nature 353844(1991)(717位的纈氨酸變?yōu)楦拾彼?；Murrell等，Science 25497(1991)(717位的纈氨酸變?yōu)楸奖彼?；Mullan等，Nature Genet.1345(1992)(雙突變，595位的賴氨酸和596位的甲硫氨酸變?yōu)?95位的天冬酰胺和596位的亮氨酸)。這些突變被認(rèn)為通過(guò)增加或改變從APP到Aβ的加工，特別是從APP到增量的長(zhǎng)形式的Aβ(即Aβ1-42和Aβ1-43)的加工而引起阿茨海默氏病。其它基因，例如早老素(presenilin)基因PS1和PS2的突變，被認(rèn)為間接地影響了APP的加工，從而產(chǎn)生了增量的長(zhǎng)形式Aβ(參見Hardy，TINS 20154(1997))。小鼠模型已經(jīng)被成功地用來(lái)確定淀粉樣斑在阿茨海默氏病中的重要性(Games等，同上；Johnson-Wood等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA941550(1997))。具體來(lái)說(shuō)，當(dāng)用長(zhǎng)形式的Aβ注射PDAPP轉(zhuǎn)基因小鼠(該小鼠表達(dá)突變形式的人APP，并在幼齡時(shí)就發(fā)展出阿茨海默氏病)時(shí)，它們表現(xiàn)出阿茨海默氏病發(fā)展的減慢和針對(duì)Aβ肽抗體滴度的增加(Schenk等，Nature 400173(1999))。上面討論的觀察表明Aβ，特別是它的長(zhǎng)形式，是阿茨海默氏病的一個(gè)病因。因此，存在著對(duì)治療阿茨海默氏病的新療法和藥劑，特別是能夠在生理(例如非毒性的)劑量下實(shí)現(xiàn)治療效果的療法和藥劑的需求。專利技術(shù)簡(jiǎn)述本專利技術(shù)的特征在于新的免疫藥劑，具體來(lái)說(shuō)是預(yù)防和治療生成淀粉樣疾病(例如阿茨海默氏病)的治療性抗體藥劑。本專利技術(shù)至少部分地基于一種單克隆抗體的識(shí)別和鑒定，該抗體與Aβ肽特異性結(jié)合，有效地減少了斑的產(chǎn)生和/或減少了與生成淀粉樣紊亂有關(guān)的神經(jīng)性營(yíng)養(yǎng)不良。對(duì)該抗體的結(jié)構(gòu)和功能的分析導(dǎo)致設(shè)計(jì)了各種人源化抗體用于預(yù)防和/或治療。具體來(lái)說(shuō)，本專利技術(shù)的特征在于對(duì)該抗體的可變區(qū)進(jìn)行人源化，從而提供了所述抗體的人源化免疫球蛋白或抗體鏈、完整的人源化免疫球蛋白或抗體以及功能性免疫球蛋白或抗體片段，特別是抗原結(jié)合片段。含有所述單克隆抗體的互補(bǔ)決定區(qū)的多肽也被公開了，適合于編碼該多肽的多核苷酸試劑、載體和宿主細(xì)胞也被公開。還公開了生成淀粉樣疾病或紊亂(例如阿茨海默氏病)的治療方法，以及其中使用的藥物組合物和試劑盒。本專利技術(shù)的特征為在所述單克隆抗體中對(duì)于適當(dāng)?shù)拿庖吖δ軄?lái)說(shuō)是重要的殘基的鑒定方法，以及在設(shè)計(jì)具有改善的結(jié)合親和性和/或減少的免疫原性的人源化抗體中用于治療藥劑時(shí)適合取代的殘基的鑒定方法。本專利技術(shù)的特征還在可具有改變的效應(yīng)子功能的抗體(例如人源化抗體)及其治療應(yīng)用。附圖簡(jiǎn)述附圖說(shuō)明圖1A-B描述了小鼠的12B4(成熟肽，SEQ ID NO2)、人源化的12B4(成熟肽，SEQ ID NO6)、Katat ID 005036(成熟肽，SEQ IDNO32)和種系A(chǔ)19(X63397，成熟肽，SEQ ID NO30)抗體的輕鏈的氨基酸序列的比對(duì)。CDR區(qū)為點(diǎn)畫區(qū)并上劃線。星號(hào)表示從人到小鼠的單一殘基回復(fù)突變。劃上陰影線的殘基的重要性顯示在圖例中。編號(hào)從第一個(gè)甲硫氨酸開始，不是Kabat編號(hào)。圖2A-B描述了小鼠的12B4(成熟肽，SEQ ID NO4)、人源化的12B4(第一版)(成熟肽，SEQ ID NO8)、Katat ID 000333(成熟肽，SEQ ID NO34)和種系VH4-39和VH4-61抗體(成熟肽，分別為SEQ ID NO38和36)的重鏈的氨基酸序列的比對(duì)。注解同圖1。編號(hào)從第一個(gè)甲硫氨酸開始，不是Kabat編號(hào)。圖3A-D描述了人源化的12B4 VLv1與嵌合的12B4 VL(與鼠12B4 VL具有相同的可變區(qū)序列，分別為SEQ ID NO1和2)、種系A(chǔ)19序列(分別為SEQ ID NO29和30)以及Kabid ID 005036(分別為SEQID NO31和32)的核苷酸和氨基酸序列的比較。圖4A-D描述了人源化的12B4 VHv1與嵌合的12B4 VH(與鼠12B4 VH具有相同的可變區(qū)序列，分別為SEQ ID NO3和4)、Kabat ID000333(分別為SEQ ID NO33和34)以及種系VH4-61(分別為SEQID NO35和36)的核苷酸和氨基酸序列的比較。圖5圖解地描述了兩個(gè)獨(dú)立的測(cè)量嵌合12B4、3D6和嵌合3D6與Aβ結(jié)合的實(shí)驗(yàn)的ELISA結(jié)果(分別為圖A和B)。圖6圖解地描述了競(jìng)爭(zhēng)性的ELISA結(jié)合，用于證實(shí)12B4和嵌合的12B4與3D6、嵌合的3D6和10D5相比的功能活性。嵌合的12B4(空心三角形)和它的非生物素化的鼠對(duì)應(yīng)物(空心倒三角形)與生物素化的鼠12B4競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合Aβ1-42肽的能力相同。圖7圖解地描述了一個(gè)離體的吞噬作用分析，測(cè)試了嵌合的12B4、3D6和人的IgG1在PDAPP腦切片上通過(guò)小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)攝取Aβ的能力。圖8圖解地描述了兩個(gè)獨(dú)立的離體吞噬作用分析的結(jié)果(分別為圖A和圖B)，該分析測(cè)試了嵌合的12B4、人源化的3D6和本文檔來(lái)自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一種人源化免疫球蛋白輕鏈，含有來(lái)自ＳＥＱＩＤＮＯ：２所顯示的１２Ｂ４免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)序列的可變區(qū)互補(bǔ)決定區(qū)（ＣＤＲｓ），并含有來(lái)自人受體免疫球蛋白輕鏈序列的可變框架區(qū)，條件是至少一個(gè)框架殘基被來(lái)自小鼠１２Ｂ４輕鏈可變區(qū)序列的相應(yīng)氨基酸殘基取代，其中框架殘基選自：（ａ）直接非共價(jià)結(jié)合抗原的殘基；（ｂ）臨近ＣＤＲ的殘基；（ｃ）與ＣＤＲ相互作用的殘基；以及（ｄ）參與ＶＬ－ＶＨ界面的殘基。

【技術(shù)特征摘要】
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【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：古里克巴西，喬斯薩爾達(dá)尼亞，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：艾蘭制藥國(guó)際有限公司，惠氏公司，
類型：發(fā)明
國(guó)別省市：IE[愛(ài)爾蘭]