利用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體表達(dá)轉(zhuǎn)基因鳥類中的基因的方法以及由此得到的轉(zhuǎn)基因鳥類技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)提供一種利用復(fù)制能力缺失型逆轉(zhuǎn)錄病毒載體導(dǎo)入抗體基因，通過表達(dá)轉(zhuǎn)基因生產(chǎn)抗體的Ｇ０轉(zhuǎn)基因嵌合鳥類，和通過回收該Ｇ０轉(zhuǎn)基因嵌合鳥類表達(dá)的抗體生產(chǎn)抗體的方法，以及Ｇ０轉(zhuǎn)基因嵌合鳥類的生產(chǎn)方法，該方法包括孵育鳥類受精卵，除去緊隨孵卵開始后的時(shí)期，往其后的受精卵中注入逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。即，本發(fā)明專利技術(shù)涉及一種利用復(fù)制能力缺失型逆轉(zhuǎn)錄病毒載體導(dǎo)入抗體基因，通過表達(dá)轉(zhuǎn)基因生產(chǎn)抗體的Ｇ０轉(zhuǎn)基因嵌合鳥類。（*該技術(shù)在2023年保護(hù)過期，可自由使用*）

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
【國(guó)外來華專利技術(shù)】
本專利技術(shù)涉及能在血液和卵中產(chǎn)生抗體(例如scFv-Fc抗體)的G0轉(zhuǎn)基因嵌合鳥類。本專利技術(shù)還涉及生產(chǎn)抗體的方法，該方法包括產(chǎn)生利用復(fù)制能力缺失型逆轉(zhuǎn)錄病毒載體導(dǎo)入了外源抗體基因的G0轉(zhuǎn)基因嵌合鳥類，并從該鳥類的血、卵白或卵黃中回收產(chǎn)生的抗體。進(jìn)一步地，本專利技術(shù)還涉及制備高效表達(dá)轉(zhuǎn)基因的G0轉(zhuǎn)基因嵌合鳥類的方法、以及通過該制備方法獲得的G0轉(zhuǎn)基因嵌合鳥類。
技術(shù)介紹
作為基因功能的研究方法，目前正盛行研究把外源基因整合到宿主中的基因?qū)?轉(zhuǎn)基因)動(dòng)物。這些轉(zhuǎn)基因動(dòng)物不僅可以用于基礎(chǔ)研究，還可以用于品種改良、物質(zhì)生產(chǎn)、移植器官的供體和產(chǎn)業(yè)應(yīng)用等。使牛、山羊、綿羊等在乳汁中產(chǎn)生生理活性物質(zhì)的嘗試已經(jīng)接近于實(shí)用，其代表性例子是α1-抗胰蛋白酶和抗凝血酶目前正處于臨床試驗(yàn)階段，旨在將其作為藥物應(yīng)用。以鵪鶉和雞為代表的家禽類作為肉食用、產(chǎn)卵用家畜已經(jīng)有很長(zhǎng)的飼養(yǎng)史，為了進(jìn)行轉(zhuǎn)基因研究，也正在考慮有關(guān)提高抗病性、肉質(zhì)質(zhì)量等品種改良的各種嘗試。另外，鳥類的性成熟時(shí)間短，并且可以在小的空間內(nèi)飼養(yǎng)，因此能以低成本實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)表達(dá)系統(tǒng)，有望作為抗體藥物或稀少蛋白質(zhì)的產(chǎn)生手段進(jìn)行轉(zhuǎn)基因生產(chǎn)。鳥類的卵含有大量蛋白質(zhì)，并且每天連續(xù)生產(chǎn)，因此，如果能有意識(shí)地在卵中以重組蛋白的形式產(chǎn)生基因轉(zhuǎn)導(dǎo)產(chǎn)物，則可以得到高效的生產(chǎn)系統(tǒng)。近年來數(shù)量眾多的品種陸續(xù)上市，作為藥物備受關(guān)注的單克隆抗體不能利用大腸桿菌等的廉價(jià)表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)，因此價(jià)格昂貴，阻礙了其普及應(yīng)用。鳥類細(xì)胞具有構(gòu)成抗體蛋白質(zhì)的功能，轉(zhuǎn)基因鳥類有望作為以往難于大量生產(chǎn)的醫(yī)療用抗體等的生產(chǎn)途徑。并且，鳥類細(xì)胞使這些蛋白質(zhì)產(chǎn)物添加了糖鏈，由此提高了在血液中的穩(wěn)定性等，具有作為藥物、檢測(cè)試劑應(yīng)用的有利性質(zhì)的可能性更高。這樣，雖然迄今為止在期待用作有用蛋白質(zhì)生產(chǎn)途徑的轉(zhuǎn)基因鳥類中進(jìn)行了各種試驗(yàn)，但尚沒有使鳥卵在實(shí)用水平上蓄積重組蛋白的例子。另外，也沒有報(bào)告高濃度地表達(dá)抗體等由多個(gè)單元構(gòu)成的具有高級(jí)結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)基因鳥類的例子。Harvey等(Harvey，A.J等(2002)Nature Biotechnology.19，396)用來自禽白血病病毒的載體將β-內(nèi)酰胺酶導(dǎo)入雞中產(chǎn)生了G0轉(zhuǎn)基因嵌合雞，但血清或卵中的酶表達(dá)量為50～250ng/ml左右。通過該G0轉(zhuǎn)基因嵌合雞交配產(chǎn)生的G1～G3轉(zhuǎn)基因雞全身的體細(xì)胞中導(dǎo)入了基因，雖然由此增加了酶的表達(dá)量，但還是停留在數(shù)μg/ml的水平，該值離實(shí)用還差很遠(yuǎn)。制備轉(zhuǎn)基因動(dòng)物時(shí)，一般采用往受精卵的前核中顯微注射DNA的方法，但鳥類不能采用該方法，原因是鳥類中難于獲得單細(xì)胞期的胚，即使獲得了也沒有識(shí)別卵內(nèi)的核的方法。為了獲得單細(xì)胞期的胚，必須從雌性鳥類的輸卵管內(nèi)獲得受精不久的卵，并使其正常發(fā)育。近年P(guān)erry獲得了雞的卵裂前細(xì)胞，并確立了體外培養(yǎng)系統(tǒng)(Perry，M.M(1988)Nature，331)，但通過該方法也不能分辨卵內(nèi)的核并往核內(nèi)導(dǎo)入目的基因。因此，鳥類受精卵的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)限于往細(xì)胞質(zhì)中注入DNA，可以嘗試在脂質(zhì)二層膜(脂質(zhì)體)中包含DNA的方法或磷酸鈣法、電導(dǎo)入法(電穿孔法)。但這些方法的基因?qū)胄什睿⑶覍?dǎo)入的質(zhì)粒DNA整合到染色體中的可靠性低。通過顯微注射的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)法可以高效地將目的DNA輸送到受精卵中，但導(dǎo)入的質(zhì)粒DNA不整合到宿主染色體中，因此隨著宿主體細(xì)胞的分裂，轉(zhuǎn)基因質(zhì)粒丟失，沒有希望獲得穩(wěn)定的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)效果。1986年初報(bào)告了通過逆轉(zhuǎn)錄病毒載體制備轉(zhuǎn)基因雞的例子(Salter，D.W等(1986)Poultry Sci.，65)。通過顯微注射法將逆轉(zhuǎn)錄病毒載體注入受精卵的方法是基因轉(zhuǎn)導(dǎo)效率高的方法，在那些不能往核內(nèi)直接注入DNA的鳥類中，是往染色體中插入目的基因產(chǎn)生穩(wěn)定的轉(zhuǎn)基因的唯一實(shí)用的方法。本專利技術(shù)反復(fù)進(jìn)行悉心研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)了轉(zhuǎn)基因鳥類制備方法，該方法使用基因治療也用到的安全的自主復(fù)制能力缺失型病毒載體，高效地導(dǎo)入目的基因(特開2002-176880號(hào)公報(bào))。由此可以安全并且高效地構(gòu)建具有多個(gè)轉(zhuǎn)基因拷貝數(shù)的轉(zhuǎn)基因鳥類。另外，通過該方法，轉(zhuǎn)基因可以高效地傳遞給子代，轉(zhuǎn)基因鳥類作為物質(zhì)生產(chǎn)系統(tǒng)的應(yīng)用已經(jīng)接近實(shí)用。然而，此時(shí)導(dǎo)入的基因由于大部分在發(fā)育初期被宿主滅活(稱作基因沉默)，基因表達(dá)的結(jié)果只產(chǎn)生微量蛋白質(zhì)。轉(zhuǎn)基因失活的生物學(xué)機(jī)理尚不明確，但避免這種失活、使目的基因高效表達(dá)的技術(shù)對(duì)轉(zhuǎn)基因鳥類的應(yīng)用開發(fā)是必須的。專利技術(shù)概述為了確定通過逆轉(zhuǎn)錄病毒載體導(dǎo)入到受精卵中的基因在發(fā)育后失活的時(shí)間，本專利技術(shù)人以β-半乳糖苷酶表達(dá)基因?yàn)橹笜?biāo)，研究在受精后的各個(gè)時(shí)期導(dǎo)入載體后表達(dá)量的變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因的表達(dá)量隨該基因是在胚胎發(fā)育的哪個(gè)時(shí)期導(dǎo)入而顯著變化，從而完成本專利技術(shù)。即，對(duì)于抱卵(spawning)后立即導(dǎo)入的基因，轉(zhuǎn)基因的失活明顯，而在抱卵后經(jīng)過一定時(shí)間再導(dǎo)入的基因表達(dá)頻率高。本專利技術(shù)人利用了這一見解并發(fā)現(xiàn)，如果從開始孵卵時(shí)開始，經(jīng)過特定的時(shí)間(該時(shí)間取決于鳥的種類)后往早期胚中導(dǎo)入外源基因，則可能高效地表達(dá)目的基因，而不受宿主導(dǎo)致的失活的影響。進(jìn)一步地，本專利技術(shù)人制備整合了下述基因的載體，該基因編碼用作藥物的嵌合抗體，例如scFv-Fc(單鏈抗體)，然后通過該方法將其導(dǎo)入鵪鶉(quail)中，以制備G0轉(zhuǎn)基因嵌合鳥類，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該轉(zhuǎn)基因產(chǎn)生的抗體在血液、卵白和卵黃中高濃度地表達(dá)。即，本專利技術(shù)第一方面涉及制備G0轉(zhuǎn)基因嵌合鳥類的方法和通過該方法得到的G0轉(zhuǎn)基因嵌合鳥類，該方法包括孵育鳥受精卵，在緊隨抱卵后的囊胚期(X期)之后，早期胚用復(fù)制能力缺失型逆轉(zhuǎn)錄病毒載體感染，并孵化該胚。本專利技術(shù)第二方面涉及G0轉(zhuǎn)基因嵌合鳥類，該G0轉(zhuǎn)基因嵌合鳥類中通過復(fù)制能力缺失型逆轉(zhuǎn)錄病毒載體導(dǎo)入了外源抗體基因，其特征在于，在血、卵白和卵黃中的至少一種中產(chǎn)生來自該轉(zhuǎn)基因的抗體。本專利技術(shù)第三方面涉及生產(chǎn)抗體的方法，該方法包括制備上述G0轉(zhuǎn)基因嵌合鳥類，并從該G0轉(zhuǎn)基因嵌合鳥類的血和/或卵中回收抗體。已經(jīng)確認(rèn)本專利技術(shù)G0轉(zhuǎn)基因嵌合鳥類的轉(zhuǎn)基因表達(dá)甚至保持到該鳥類長(zhǎng)大為成鳥。因此，通過本專利技術(shù)可以往鳥類中導(dǎo)入特定的基因，即使在成長(zhǎng)后也產(chǎn)生目的蛋白質(zhì)，從而構(gòu)建一種實(shí)用的生產(chǎn)體系。另外，本專利技術(shù)制備的G0轉(zhuǎn)基因嵌合鳥類的轉(zhuǎn)基因通過交配以高傳播率傳遞給子代。由于轉(zhuǎn)基因以整合在染色體中的形式傳遞給子代，因此，利用該轉(zhuǎn)基因鳥類的生產(chǎn)體系可以進(jìn)行穩(wěn)定的物質(zhì)生產(chǎn)。通過本專利技術(shù)，轉(zhuǎn)基因鳥類體細(xì)胞中產(chǎn)生的目的蛋白質(zhì)分泌到血液中，從而可以從血清中分離并利用。進(jìn)一步地，本專利技術(shù)還發(fā)現(xiàn)，具有人IgG恒定區(qū)的抗體或者具有鵪鶉IgG、雞IgG或小鼠IgG恒定區(qū)的抗體在鵪鶉和雞中高效地從血液轉(zhuǎn)移到卵中。當(dāng)具有這些恒定區(qū)的抗體在通過本專利技術(shù)方法制備的G0轉(zhuǎn)基因嵌合鳥類中表達(dá)時(shí)，血液中分泌的抗體在卵中高濃度蓄積。往轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中導(dǎo)入基因以獲得目的蛋白質(zhì)時(shí)，哺乳動(dòng)物中一般是使蛋白質(zhì)分泌到乳汁中并回收，但在轉(zhuǎn)基因鳥類中，是使目的物在卵中蓄積，然后從其卵白、卵黃中回收并純化。在雞蛋等中，全部成分的30％為蛋白質(zhì)，作為其主成分的蛋白質(zhì)為卵清蛋白。作為在轉(zhuǎn)基因鳥類的卵中使重組蛋白表達(dá)的方法，以往的觀點(diǎn)是利用卵清蛋白等的表達(dá)啟動(dòng)子，在其下游整合編碼目的蛋白質(zhì)的基因，使目的物在卵白而不是卵清蛋白中表達(dá)。然而，在本專利技術(shù)的方法中，本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一種Ｇ０轉(zhuǎn)基因嵌合鳥類，該鳥類通過復(fù)制能力缺失型逆轉(zhuǎn)錄病毒載體導(dǎo)入了外源抗體基因，其特征在于，在血、卵白和卵黃的至少一種中產(chǎn)生來自轉(zhuǎn)基因的抗體。

【技術(shù)特征摘要】
【國(guó)外來華專利技術(shù)】...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：飯島信司，上平正道，西島謙一，小野健一郎，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：株式會(huì)社鐘化，財(cái)團(tuán)法人名古屋產(chǎn)業(yè)科學(xué)研究所，
類型：發(fā)明
國(guó)別省市：JP[日本]