一種抗體生產方法技術

本發明專利技術公開了一種抗體生產方法。本發明專利技術從細胞培養的代謝過程出發，通過向流加培養液中添加蛋白水解物，使其在表達過程中營養充分并對部分電荷異質性的修飾和降解起到抑制和阻止作用，從而能穩定、有效地改善抗體產品的電荷異質性及增加抗體的表達量，該方法能有效地解決抗體生產中電荷異質性的問題，并保持或提高產量。

An antibody production method

The invention discloses an antibody production method. The metabolic process of the invention from the cell culture of flow through to the added protein hydrolysate in the culture medium, the expression in the process and to inhibit and prevent adequate nutrition on the part of the charge heterogeneity modification and degradation, which can effectively improve the stability, the charge heterogeneity of antibody products and increase antibody the expression, this method can effectively solve the heterogeneity problem in charge of antibody production, and maintain or improve the yield.

【技術實現步驟摘要】
一種抗體生產方法
本專利技術涉及生物制藥領域，特別涉及一種通過添加蛋白水解物改善抗體電荷異質性的生產方法，該生產方法同時能保持或提高產量。
技術介紹
目前，單抗類藥物因其特定的靶向性及較低的毒副作用，在藥品市場上迅速發展。2016年全球單抗市場銷售額達1000億美金，其中“藥王”阿達木單抗銷售額達160億美金。單抗藥物由于其分子量大及復雜的高級結構修飾，其通常由哺乳動物細胞所表達，其中CHO細胞是表達單抗的最主流的宿主細胞。但是，抗體在生產過程中由于受到復雜培養環境的影響，經常會出現一些電荷異質體，而其電荷異質性會影響抗體的藥物分布和藥代動力學。在很多抗體藥物生產過程中，電荷異質性被認為是關鍵質量屬性。引起抗體電荷異質性的原因有：不同程度的翻譯后修飾和化學降解，如脫酰胺、氧化、糖基化、糖化、還原二硫鍵、賴氨酸殘留、N末端焦谷氨酸環化、異構化。出現電荷異質性的宏觀表現為：在WCX-HPLC檢測下，主峰前后有酸性峰和堿性峰出現。在已有的一些文獻中，報道了降低溫度可以減少酸性電荷變體含量、光照的不同程度也會影響酸性電荷變體含量、降低表達階段的pH也能降低部分酸性電荷變體含量、培養基中添加Cu2+、Ca2+離子也能對電荷異質體產生影響。但是這些手段對電荷變體的調節范圍有限，且通用性較差，同時對抗體的產量并無明顯提高。
技術實現思路
本專利技術提供一種通過添加蛋白水解物的流加培養方式改善抗體電荷異質性并保持或提高產量的生產方法。本專利技術從細胞培養的代謝過程出發，通過向流加培養液中添加蛋白水解物，使得其表達過程中營養充分并且對部分電荷異質性的修飾和降解起到抑制和阻止作用，從而能穩定、有效地改善抗體產品的電荷異質性及保持或增加抗體的表達量，該方法能有效地解決抗體生產中電荷異質性和產量的問題。此外，本專利技術在不同的細胞株、不同的基礎培養液、及流加培養液中添加不同濃度的蛋白水解物中均能有效地改善其電荷異質性及增加抗體產量，其方法具有極廣的適應性。其中，最優方案中，酸性電荷變體含量從23.4％降為12.3％，主峰由58.9％上升至74.5％,，同時表達量由1.8g/L增加至3.6g/L，為單克隆抗體在生產過程中產品質量和產量的提升提供一種非常簡便、有效、穩定的方法。本專利技術的技術方案如下：一種抗體生產方法，適用于使用GS-CHO細胞系構建的細胞株，所述抗體采用流加培養方式生產，并且流加培養液中含有蛋白水解物。較佳地，所述流加培養方式包括如下步驟：(a)在細胞培養裝置中加入基礎培養液，接種GS-CHO抗體表達細胞株，接種后在37℃條件下進行常規培養；(b)培養至第2-7天后，將培養溫度降至30-34℃，并開始進行含蛋白水解物的流加培養液的流加，直至培養結束。具體的較佳流加開始時間可根據細胞密度進行調整。優選地，所述培養結束為：待細胞活率降至50％或細胞密度低于最高細胞密度的1/3時結束細胞培養，并收獲上清液。較佳地，所述流加培養液中的所述蛋白水解物的濃度為100g/L以下。優選地，所述流加的方法為：每兩天流加一次，每次添加的所述流加培養液的體積依次為培養體積的5％、2％、5％、2％、5％；上述流加方法操作一個循環或兩個循環，在操作兩個循環時，在第一輪流加方法完成后進行第二個循環。優選地，所述流加培養液選自FeedC、PFF05、Feed210、Feed200的一種或多種。優選地，所述基礎培養液選自Dynamis、T54、CellventoTMCHO-210、CellventoTMCHO-200、ApmliCHOCD、OPM-CD11V的一種或多種。優選地，所述接種的抗體表達細胞株的細胞密度為(0.2-5×106cells/ml)。優選地，所述蛋白水解物為植物來源的蛋白水解物。進一步優選地，所述蛋白水解物為大豆或者玉米的蛋白水解物。與現有技術相比，本專利技術的有益效果如下：第一，本專利技術的抗體生產方法改善了抗體電荷異質性，降低了抗體的酸性峰含量，增加了抗體的主峰含量；第二，本專利技術的抗體生產方法增加了抗體產量。當然，實施本專利技術的任一產品并不一定需要同時達到以上所述的所有優點。附圖說明圖1是本專利技術實施例1的流加培養液中添加蛋白水解物對不同細胞株抗體酸性峰含量的影響柱狀圖；圖2是本專利技術實施例1的流加培養液中添加蛋白水解物對不同細胞株抗體主峰含量的影響柱狀圖；圖3是本專利技術實施例1的流加培養液中添加蛋白水解物對不同細胞株抗體產量的影響柱狀圖；圖4是本專利技術實施例2的不同基礎培養液中添加含蛋白水解物的流加培養液對細胞株抗體酸性峰含量的影響柱狀圖；圖5是本專利技術實施例2的不同基礎培養液中添加含蛋白水解物的流加培養液對細胞株抗體主峰含量的影響柱狀圖；圖6是本專利技術實施例2的不同基礎培養液中添加含蛋白水解物的流加培養液對細胞株抗體產量的影響柱狀圖；圖7是實施例3中流加培養液中添加不同濃度的蛋白水解物對細胞株2抗體酸性峰含量的影響柱狀圖；圖8是實施例3中流加培養液中添加不同濃度的蛋白水解物對細胞株2抗體主峰含量的影響柱狀圖；圖9是實施例3中流加培養液中添加不同濃度的蛋白水解物對細胞株2抗體產量的影響柱狀圖；圖10是實施例4中流加培養液中添加不同濃度的蛋白水解物對細胞株3抗體酸性峰含量的影響柱狀圖；圖11是實施例4中流加培養液中添加不同濃度的蛋白水解物對細胞株3抗體主峰含量的影響柱狀圖；圖12是實施例4中流加培養液中添加不同濃度的蛋白水解物對細胞株3抗體產量的影響柱狀圖。具體實施方式本專利技術提供一種通過流加方法在培養體系中添加蛋白水解物改善抗體電荷異質性和產量的生產方法。在本文中，由「一數值至另一數值」表示的范圍，是一種避免在說明書中一一列舉該范圍中的所有數值的概要性表示方式。因此，某一特定數值范圍的記載，涵蓋該數值范圍內的任意數值以及由該數值范圍內的任意數值界定出的較小數值范圍，如同在說明書中明文寫出該任意數值和該較小數值范圍一樣。下面結合具體實施例，進一步闡述本專利技術。以下實施例、實驗例進一步詳細地描述了本專利技術，但應該理解，以下列舉的這些實施例僅用于進一步說明本專利技術的技術方案以幫助本領域技術人員的理解本專利技術，而不限定本專利技術的保護范圍。在實際應用中本領域技術人員在本專利技術揭示的范圍內根據以下實施例做出的改進和調整，仍屬于本專利技術的保護范圍。實施例1本實施例的抗體生產過程如下：(a)在細胞培養瓶中加入基礎培養液，接種GS-CHO抗體表達細胞株，接種后在37℃條件下進行常規培養；(b)培養一定時間后(第4天)，培養溫度降至34℃；同時在第4天開始以如下的策略進行含蛋白水解物流加培養液的流加，直至培養結束：每兩天流加一次，每次添加的所述流加培養液的體積依次為培養體積的5％、2％、5％、2％、5％；c)待細胞活率降至50％或細胞密度低于最高細胞密度的1/3時結束細胞培養，收獲上清液。其中，基礎培養液為Dynamis；流加培養液為FeedC；接種的抗體表達細胞株為GS-CHO細胞抗體表達株1,2,3，GS-CHO細胞抗體表達株1,2,3分別為：抗CD-52抗體表達株，抗IgE抗體表達株，抗VEGF抗體表達株，來自上海泰因生物技術有限公司；抗體表達細胞株的細胞接種密度為1.0*106cells/ml)；蛋白水解物為大豆蛋白水解物，添加濃度為100g/L；同時，本實施例以不添加蛋白本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種抗體生產方法，適用于使用GS?CHO細胞系構建的細胞株，其特征在于，所述抗體采用流加培養方式生產，并且流加培養液中含有蛋白水解物。

【技術特征摘要】
1.一種抗體生產方法，適用于使用GS-CHO細胞系構建的細胞株，其特征在于，所述抗體采用流加培養方式生產，并且流加培養液中含有蛋白水解物。2.如權利要求1所述的抗體生產方法，其特征在于，所述流加培養方式包括如下步驟：(a)在細胞培養裝置中加入基礎培養液，接種GS-CHO抗體表達細胞株，接種后在37℃條件下進行常規培養；(b)培養至第2-7天后，將培養溫度降至30-34℃，并開始進行含蛋白水解物的流加培養液的流加，直至培養結束。3.如權利要求2所述的抗體生產方法，其特征在于，所述培養結束為：待細胞活率降至50％或細胞密度低于最高細胞密度的1/3時結束細胞培養，并收獲上清液。4.如權利要求1或2所述的抗體生產方法，其特征在于，所述流加培養液中的所述蛋白水解物的濃度為100g/L以下。5.如權利要求1或2所述的抗體生產方法，其特征在于，所述流加的方法為：每兩天流加一次，每次添加的所述流加培養液的體積...

【專利技術屬性】
技術研發人員：秦金燕，鄭琛，齊念民，莊超，錢慧，傅強，伍翔，
申請(專利權)人：上海泰因生物技術有限公司，
類型：發明
國別省市：上海,31