蛋白的高水平表達制造技術

一種編碼在真核細胞中正常表達的蛋白的合成基因，其中在編碼所述蛋白的天然基因中，至少１個非優選或較不優選的密碼子已被編碼相同氨基酸的優選密碼子所置換，在體外哺乳動物細胞培養系統中，在相等條件下，所述的合成基因能表達的該蛋白水平，至少為所述的天然基因表達水平的１１０％。（*該技術在2017年保護過期，可自由使用*）

【技術實現步驟摘要】
【國外來華專利技術】
本專利技術涉及在真核細胞中，高水平表達真核生物蛋白和病毒蛋白的基因和方法。
技術介紹
在原核生物中表達真核基因產物，有時因存在在大腸桿菌中不常使用的密碼子而受到限制。上述基因的表達，可用高表達原核基因的密碼子系統地替換內源密碼子的方法而增強(Robinson等，核酸研究126663,1984)。一般認為，稀有密碼子引起核糖體暫停，導致不能完成新生的多肽鏈和轉錄及翻譯的解偶聯。核糖體的暫停被認為引起mRNA的3′末端與細胞的核糖核酸酶的接觸。專利技術概述本專利技術涉及一種合成的基因，該基因編碼在哺乳動物細胞或其它真核生物細胞中正常地表達的蛋白，其中在編碼該蛋白的天然基因中，至少一個非優選的或較不優選的密碼子已被編碼相同氨基酸的優選密碼子所置換。優選的密碼子是Ala(gcc)；Arg(cgc)；Asn(aac)；Asp(gac)；Cys(tgc)’Gln(cag)；Gly(ggc)；His(cac)；Ile(atc)；Leu(ctg)；Lys(aag)；Pro(ccc)；Phe(ttc)；Ser(agc)；Thr(acc)；Tyr(tac)；和Val(gtg)。較不優選的密碼子是Gly(ggg)；Ile(att)；Leu(ctc)；Ser(tcc)；Val(gtc)和Arg(agg)。所有不符合優選密碼子和較不優選的密碼子說明的密碼子為非優選密碼子。一般來說，特殊密碼子的優選程度由在高表達的人類基因中密碼子的使用程度來表示，如在表1中標題“高”下所列出。例如，在高表達的哺乳動物基因中，“atc”代表77％的Ile密碼子、是優選的Ile密碼子。在高表達的哺乳動物基因中，“att”代表18％的Ile密碼子，為較不優選的Ile密碼子。在高表達的人類基因中，“ata”序列僅代表5％的Ile密碼子，稱為非優選的Ile密碼子。用在高表達的人類基因中更常出現的另一個密碼子置換密碼子，一般來說會增加基因在哺乳動物細胞中表達。相應地，本專利技術包括用優選的密碼子取代較不優選的密碼子，以及用優選或較不優選的密碼子置換非優選的密碼子。“在哺乳動物細胞中正常表達的蛋白”指的是自然條件下在哺乳動物中表達的蛋白。該術語包括在哺乳動物基因組中的基因，如編碼因子Ⅷ、因子Ⅸ、白細胞介素和其它蛋白的基因。該術語也包括在疾病條件下哺乳動物細胞中表達的基因，如癌基因及在感染后哺乳動物細胞表達的由病毒(包括逆轉錄病毒)所編碼的基因。術語“在真核細胞中正常表達的蛋白”，指的是自然條件下在真核生物中表達的蛋白。該術語也包括疾病條件下在哺乳動物細胞中表達的基因。在優選的實施方案中，在體外哺乳動物細胞培養系統中，在相同的條件下(即，同樣細胞類型、同樣的培養條件、同樣的表達載體)，合成的基因能夠表達哺乳動物或真核生物蛋白的水平至少為“天然的”(或“天生的”)基因所表達的110％、150％、200％、500％、1,000％、5,000％，或甚至為10,000％。如下描述了用于測定合成的基因和相應的天然基因表達的合適的細胞培養系統。其它合適的采用哺乳動物細胞的表達系統，在本領域的技術人員中是眾所周知的，并在下面注明的標準的分子生物學參考書中有描述。下面和如下所述的標準參考書中描述了適于表達合成基因和天然基因的載體。術語“表達”意指蛋白表達。用對目的蛋白特異的抗體測定表達。上述抗體和測定技術在本領域的技術人員中眾所周知。術語“天然基因”和“天生基因”，意指天然地編碼蛋白的基因序列(包括天然發生的等位變異體)，即天生或天然的編碼序列。在其他優選的實施方案中，天然基因中至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％的密碼子是非優選的密碼子。在其他優選的實施方案中，天然基因中至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％的非優選密碼子被優選密碼子或較不優選的密碼子所置換。在其他優選的實施方案中，天然基因中至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％的非優選密碼子可以用優選密碼子或較不優選的密碼子所置換。在一優選的實施方案中，蛋白是逆轉錄病毒蛋白。在一更優選的實施方案中，蛋白是慢病毒蛋白。在進一步更優選的實施方案中，蛋白是HIV蛋白。在其他優選的實施方案中，蛋白是gag、pol、env、gp120或gp160。在其他優選的實施方案中，蛋白是人蛋白。在更優選的實施方案中，蛋白是人因子Ⅷ和B區缺失的人因子Ⅷ的蛋白。在另一優選的實施方案中，蛋白是綠色熒光蛋白。在各種優選的實施方案中，合成基因中至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％和95％的密碼子是優選的或較不優選的密碼子。本專利技術也涉及包含合成基因的表達載體。在另一方面，本專利技術涉及包含合成基因的細胞。在各種優選的實施方案中，細胞是原核細胞，以及細胞是哺乳動物細胞。在優選的實施方案中，合成基因包括比50更少、比40更少、比30更少、比20更少、比10更少、比5更少或沒有“cg”的序列。本專利技術也涉及提供一種制備合成基因的方法，該合成基因編碼，由哺乳動物細胞或其它真核細胞正常表達的蛋白。該方法包括，在編碼蛋白的天然基因中鑒別非優選的和較不優選的密碼子，并且用編碼相同氨基酸的優選密碼子作為置換密碼子，置換一個或多個非優選和較不優選的密碼子。在某些情況下(例如，允許引入限制性位點)，可能需要用較不優選的密碼子而不是優選密碼子置換非優選密碼子。沒有必要用優選的密碼子置換所有較不優選的或非優選的密碼子。甚至用優選的密碼子部分置換較不優選或非優選的密碼子就可實現表達的增加。在某些情況下，為了獲得中等水平的表達，用優選的或較不優選的密碼子僅僅部分置換非優選密碼子，就可合乎要求。在其他優選的實施方案中，本專利技術涉及包含一種或多種合成基因的載體(包括表達載體)。術語“載體”意指一種如來源于質粒、噬菌體、或哺乳動物或昆蟲病毒的DNA分子，DNA片段可插入或克隆進載體之中。載體可含有一個或多個唯一的限制性位點，能在確定的宿主或載體生物自主復制，這樣克隆序列是可以重復產生的。因此，術語“表達載體”意指任何能指導蛋白合成的自主元件。上述DNA表達載體包括哺乳動物質粒和病毒。本專利技術也涉及編碼蛋白所需部分的合成基因片段。除了它們僅編碼蛋白的一部分外，上述合成基因片段與本專利技術的合成基因相似。優選的上述合成基因片段，至少編碼蛋白50、100、150或500個鄰近的氨基酸。在構建本專利技術的合成基因中，避免CpG序列合乎要求。因為這些序列可引起基因沉默。因此，在一優選的實施方案中，合成基因的編碼區不包括“cg”序列。在HIV gp120env基因中存在的密碼子偏倚，也在gag和pol基因中存在。因而，在這些基因中找到的非優選和較不優選的一部分密碼子，用優選的密碼子置換應該產生能較高水平表達的基因。在編碼因子Ⅷ和因子Ⅸ的人基因中，大部分密碼子是非優選的密碼子或較不優選的密碼子。用優選的密碼子置換一部分這些密碼子，應該產生能在哺乳動物細胞培養中更高水平表達的基因。本專利技術的合成基因能導入到活生物的細胞中。例如，載體(病毒或非病毒)能用于把合成基因導入到活生物的細胞中，以進行基因治療。反之，作為一種降低表達的方法用較不優選的密碼子置換天然產生的基因中的優選密碼子是合乎需要本文檔來自技高網...

【技術保護點】

【技術特征摘要】
【國外來華專利技術】

【專利技術屬性】
技術研發人員：B·瑟德，J·哈斯，
申請(專利權)人：綜合醫院公司，
類型：發明
國別省市：