本發明專利技術涉及新鑒定出的基因，其編碼檸檬酸（生物）合成中涉及的蛋白質。本發明專利技術還涉及：包含所述新穎基因的全長多核苷酸序列的多核苷酸及其片段，所述多核苷酸編碼的新穎的多肽及其片段，以及它們的功能等同物。本發明專利技術還涉及所述多核苷酸和多肽作為生物技術工具在從微生物生產檸檬酸中的用途，其中對所述多核苷酸和／或被編碼的多肽的修飾對所述微生物中生產發酵產物的產率、產量和／或效率有著直接或間接的影響。本發明專利技術還包括使用多核苷酸和經修飾的多核苷酸序列轉化宿主微生物的方法／工藝。本發明專利技術還涉及經過遺傳工程改造的微生物及其用于生產檸檬酸的用途。
【技術實現步驟摘要】
【國外來華專利技術】用于工業生產檸檬酸的基因本專利技術涉及新鑒定出的基因，其編碼檸檬酸(生物)合成中涉及的蛋 白質。本專利技術還涉及包含所述新穎基因的全長多核苷酸序列的多核苷酸 及其片段，所述多核苷酸編碼的新穎的多肽及其片段，以及它們的功能等 同物。本專利技術還涉及所述多核苷酸和多肽作為生物技術工具在從微生物生 產檸檬酸中的用途，其中對所述多核苷酸和/或被編碼的多肽的修飾對在所 述微生物中生產所述發酵產物的產率、產量和/或效率有著直接或間接的影 響。本專利技術還包括使用所述多核苷酸和經修飾的多核苷酸序列轉化宿主微 生物的方法/工藝。本專利技術還涉及經過遺傳工程改造的微生物及其用于生產 檸檬酸的用途。專利技術背景檸檬酸(2-羥基-丙烷-l，2，3-三羧酸)是已知的工業上重要的有機酸， 其可用作為，例如，食物添加劑、防腐劑或油或脂肪的穩定性，因為其具 有絡合重金屬離子，例如銅和鐵的能力。最初，從柑橘類植物中分離出檸 檬酸。對檸檬酸的化學合成也是可能的，但是，這根本不適合進行工業生 產，因為原材料昂貴，工藝復雜，產率低下。因此，在過去數十年來，人們在研究使用微生物轉化制造檸檬酸的其 它手段，這將更經濟更環保。使用不同培養方法從多種底物(包括葡萄糖或蔗糖)生產檸檬酸已被 報道于若干種微生物中，例如真菌，包括酵母。能直接生產檸檬酸的已知真菌的例子包括，例如，來自J^e^7/^屬的菌株，特別是A m'ger，或 酵母，例如y"/rcw/"，特另!j是yia;rcw/fl /ir》o/jricfl 。底物(例如，碳水化合物)向檸檬酸的轉化可能涉及很多不同的代謝 途徑，并且牽涉到很多酶促步驟，以產生檸檬酸。此外，轉運蛋白可能在 底物向擰檬酸的高效轉化中發揮重要作用。在將物質，例如碳水化合物(例如葡萄糖或糖醇)、羧酸鹽/酯、礦物 質、毒性化合物(例如反應活性氧)以及相關化合物在膜上轉運的過程中 具有活性的蛋白質(特別是轉運蛋白)，在本文中被認為涉及轉運系統 (TS)。這種轉運可以是運進胞質，運進/出線粒體、液泡、內質網、過 氧化物酶體或運經另外的膜屏障。此類蛋白在本文中被縮寫為TS蛋白， 其在檸檬酸合成中具有功能，或在細胞內合成檸檬酸的過程中具有功能。一般而言，TS蛋白是膜結合的，或者與膜結合的結構相關，它們作為 單種蛋白質或作為蛋白質復合物(例如透性酶或活性轉運蛋白)中的亞基發揮功能。TS蛋白已知負責選擇性促進、協助或使得化合物(例如，糖、糖醇、羧酸鹽/酯、礦物質、毒性化合物)能夠被轉運經過細胞膜、周質膜 或線粒體的液泡膜、內質網膜或過氧化物酶體膜。可基于其機制將TS蛋白質分為若干類。第一組轉運蛋白也被稱為離子通道，其使用來自質子運動力的能量，逆濃度梯度轉運分子。同向轉運 和反向轉運系統將兩種不同分子經過膜的移動偶聯起來(通過針對兩種不同分子具有兩個單獨結合位點的透性酶)；在同向轉運中，兩種分子以同 樣的方向被轉運；而在反向轉運中， 一種分子運進而另一種運出。還有一類被稱為"次級轉運蛋白"的轉運蛋白一一磷酸轉移酶系統(PTS)通過高能量磷酸基團從磷酸烯醇丙酮酸經由多種蛋白組分向底物 的轉移獲得能量，底物在運入時被磷酸化為磷酸酯形式。該組的離子轉運 蛋白協助在膜上的擴散，例如，陽離子擴散協助蛋白(CDF)家族，或協 助交換陰離子，例如陰離子交換蛋白(AE)家族。該組主要易化超家族(Major Facilitator Superfamily， MFS)含有多種重要的糖轉運蛋白。另一組轉運蛋白將ATP的水解與底物易位偶聯起來。這些系統被稱為 ATP結合盒(ABC)型轉運蛋白。ABC轉運系統由底物特異性結合蛋白(在革蘭氏陰性細菌中位于周質中，或者，在革蘭氏陽性細菌中與膜相 關)、整合膜結構域和面向胞質的ATP水解結構域構成。對膜轉運系統的更詳細描述可在Bamberg, E. et al (1993) "Charge transport of ion pumps on lipid bilayer membranes", Q. Rev. Biophys. 26:1-25; Findlay， J.B.C. (1991) "Structure and function of membrane transport systems",Curr. Opin. Struct. Biol.丄:804-810; Higgins, C.F. (1992) "ABC transporters from microorganism to man" Ann. Rev. Cell Biol. 3:67-113; Gennis， R.B. (1989) "Pores, channels and transporters" in: Biomembranes, Molecular Structure and Function, Springer, Heidelberg, p. 270-322; Nikaido， H. & Saier H. (1992) "Transport proteins in bacteria: common themes in their design" Science 258:936-942中找到。優選地，TS蛋白或此類蛋白的具有針對從碳水化合物合成擰檬酸的活 性或涉及所述合成的亞基選自由己糖轉運蛋白、離子轉運蛋白、激酶、透 性酶、同向轉運蛋白、反向轉運動蛋白、線粒體運載體(例如檸檬酸鹽轉 運蛋白)或三羧酸鹽運載體、線粒體組蛋白的遏制子(suppresor)和金屬 轉運蛋白(例如，錳轉運蛋白或錳抗性蛋白或鐵轉運蛋白)構成的組。在參與檸檬酸鹽/酯合成的蛋白質，特別是酶，例如參與TCA的酶， 例如，催化乙酰CoA與草酰乙酸鹽/酯縮合形成檸檬酸的酶，在本文中被 稱為涉及檸檬酸鹽/酯合成系統，并被縮寫為CS蛋白，其在檸檬酸合成中 發揮功能。優選地，CS蛋白或者此類蛋白的具有針對檸檬酸鹽/酯合成的活性或 參與檸檬酸鹽/酯合成的亞基選自由檸檬酸鹽合酶、乙醛酸循環體檸檬酸鹽 合酶、烏頭酸酶、烏頭酸鹽水合酶或水解酶以及6-磷酸果糖激酶。參與側支反應的蛋白質，特別是酶，例如，Mn依賴性線粒體超氧化 物歧化酶(MnSOD)，參與所謂的檸檬酸合成途徑"旁路"的基因，例 如，草酰乙酸水解酶、葡糖氧化酶和/或乙醇酸鹽(氧化)還原酶，可能對 檸檬酸合成的細胞內過程造成影響。此類酶在本文中被縮寫為BS蛋白或 BS酶。以前已報道過用Aspergillus的菌株來生產檸檬酸(見，例如，Karaffa and Kubicek, Appl Microbiol Biotechnol， 61:169-196, 2003)。然而，如現有技術所知，檸檬酸生產的產率和/或生產能力仍可被提高，這正是本專利技術的 目的之一。附圖說明圖1: BS08基因置換型載體pGBDEL-SODA的質粒圖譜。 該質粒用于打斷BS08基因。標出了相對于amdS標記而言的5' BS08 側翼區域(示為5， sodA)和3， BS08側翼區域(示為3， sodA) 。 BS08 3， 片段的序列在序列上覆蓋至少數百bp。通過在轉化A. niger菌株之前用限 制性酶^出I和Xwal消化來除去E. coli DNA。 圖2: BS本文檔來自技高網...
【技術保護點】
選自下述組的ＴＳ０８和／或ＴＳ０９多核苷酸或此類多核苷酸的互補鏈，所述組由： （ａ）編碼分別包含選自ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２或ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７的氨基酸序列的ＴＳ０８或ＴＳ０９多肽的多核苷酸； （ｂ）包含根據ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１或ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６的核苷酸序列的多核苷酸； （ｃ）包含下述核苷酸序列的多核苷酸，所述核苷酸序列可使用來自微生物的基因組ＤＮＡ作為模板，并分別使用根據ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３和ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４或ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８和ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９的引物組，通過核酸擴增，例如聚合酶鏈式反應，來獲得； （ｄ）多核苷酸，其包含編碼被（ａ）至（ｃ）中任一項的多核苷酸編碼的多肽的片段或衍生物的核苷酸序列，其中，在所述衍生物中，一個或多個氨基酸殘基較之所述多肽被保守取代，并且，所述片段或衍生物具有ＴＳ０８或ＴＳ０９多肽的活性； （ｅ）編碼ＴＳ０８或ＴＳ０９多肽的多核苷酸，且其互補鏈能在嚴謹條件下與（ａ）至（ｄ）中任一項所定義的多核苷酸雜交；以及 （ｆ）編碼ＴＳ０８或ＴＳ０９的多核苷酸，且其與（ａ）至（ｄ）中任一項所定義的多核苷酸至少７０％同源，例如７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８或９９％同源； 構成。...
【技術特征摘要】
【國外來華專利技術】...
【專利技術屬性】
技術研發人員：胡戈馬克卡雷爾鮑威利爾斯，多米尼奇羅伯特格洛森肯，諾爾尼古拉斯瑪麗亞伊麗莎白佩伊凡，
申請(專利權)人：帝斯曼知識產權資產管理有限公司，
類型：發明
國別省市：NL[荷蘭]
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