基因啟動子甲基化的檢測方法技術

本發明專利技術基因啟動子甲基化的檢測方法，解決了目前甲基化檢測難于重復、亞硫酸氫鈉修飾、多啟動子甲基化多重甲基化特異ＰＣＲ擴增、低擴增效率和ＭＳＰ反應等問題。具體為：首先用提取的ＤＮＡ用新鮮配制修飾試劑進行修飾，過柱后純化脫硫反應，用無水乙醇和鮭魚精子ＤＮＡ富集微量的修飾后的ＤＮＡ，進一步選用特定的ＰＣＲ　　ＧＣ　　Ｂｕｆｆｅｒ進行多重甲基化特異ＰＣＲ擴增多對基因啟動子引物指導的ＤＮＡ模板，然后電泳分析結果。本發明專利技術具有靈敏、準確、穩定、特異性等特點，降低了檢測成本，為甲基化的研究提供了新的方法。

【技術實現步驟摘要】

【技術保護點】
基因啟動子甲基化的檢測方法，具體步驟如下：　　　　（１）．亞硫酸氫鈉修飾　　　　ａ．配制試劑：用對苯二酚溶于ｄｄＨ↓［２］Ｏ中配制１０ｍｍｏｌ／Ｌ的對苯二酚溶液；用亞硫酸氫鈉溶于水中，用氫氧化鈉調ｐＨ值，以配制３．９ｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ值為５．０的亞硫酸氫鈉溶液；　　　　ｂ．修飾過程：取１μｇＤＮＡ，加ｄｄＨ↓［２］Ｏ至５０μｌ，加入３ｍｏｌ／Ｌ的ＮａＯＨ溶液５．５μｌ，５４℃放２０ｍｉｎ變性。向己變性的ＤＮＡ中加入３０μｌ１０ｍｍｏｌ／Ｌ的對苯二酚溶液和５２０μｌ３．９ｍｏｌ／Ｌ，５４℃保溫１６ｈ；然后用純化柱純化，純化后的ＤＮＡ加入５０μｌ、預溫８０℃的ｄｄＨ↓［２］Ｏ溶解，并加入３ｍｏｌ／Ｌ的ＮａＯＨ溶液５．５μｌ，２５℃放置１５ｍｉｎ，加入５６μｌ的３ｍｏｌ／Ｌ的ＮＨ４Ａｃ室溫靜止１０ｍｉｎ，修飾的ＤＮＡ用２．５倍體積預冷無水乙醇和１μｌ５ｍｇ／ｍｌ的糖原沉淀ＤＮＡ，－４０℃過夜。次日再用７０％酒精洗滌沉淀２次，干燥后用３０μｌＴＥ溶解，－４０℃保存備用。當２００ｎｇＤＮＡ樣品較少時，在純化回收時可加入適量鮭魚精ＤＮＡ作為載體，有利于ＤＮＡ沉淀；　　　　（２）．引物設計：模板ＤＮＡ在經過亞硫酸鹽處理后，發生甲基化的基因啟動子區域ＣｐＧ島內ＣｐＧ位點５′－端胞嘧啶保持不變；而未發生甲基化的ＣｐＧ島內ＣｐＧ位點５′－端胞嘧啶轉化為尿嘧啶；針對修飾前后的序列差異用ＭｅｔｈＰｒｉｍｅｒ軟件設計甲基化與未甲基引物，進行ＰＣＲ擴增；設計好的引物要用引物軟件如Ｐｒｉｍｅｒ６．０從理論上推測其擴增效率，對于擴增效率低于４０％的引物要進行優化，方法是：在核心啟動子區域前后反復調整甲基化前導引物擴增起始點，以期使引物擴增效率增高，降低擴增難度，從而提高ＰＣＲ產量。　　　　（３）．ＭＳＰ（甲基化特異性聚合酶鏈）反應：經過修飾后的模板ＤＮＡ為單鏈狀態，ＭＳＰ的ＤＮＡ模板在抽提后純度要求Ａ２６０／Ａ２８０在１．８～２．０之間，Ｍｇ２＋濃度一般在２．０ｍｍｏｌ／Ｌ；選用針對富含ＣＧ等復雜二級結構模板的ＧＣ　　Ｂｕｆｆｅｒ，擴增通用條件：９５℃預變性５分鐘，９５℃６０秒，６０℃６０秒，７２℃６０秒，３５個循環（對于血清樣品等提取的微量ＤＮＡ選用５０個循環），最后１個循環７０℃延伸５分鐘。然后在２．５％瓊脂糖凝膠電泳上溴化乙錠染色后觀測基因啟動子甲基化結果。...

【技術特征摘要】

【專利技術屬性】
技術研發人員：馮景，呂軍，王玉平，張吉才，
申請(專利權)人：馮景，呂軍，
類型：發明
國別省市：42[]