牛奶樣品布氏桿菌套式PCR檢測方法技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)牛奶樣品布氏桿菌套式ＰＣＲ檢測方法涉及基因工程技術(shù)。根據(jù)布氏桿菌１６Ｓ　　ｒＲＮＡ基因序列，設(shè)計合成套式ＰＣＲ的外向引物和內(nèi)向引物；用優(yōu)化ＣＴＡＢ－ＮａＣｌ法提取牛奶樣品細菌染色體ＤＮＡ，以外向引物和內(nèi)向引物進行二次ＰＣＲ擴增，凝膠電泳檢查ＰＣＲ產(chǎn)物，建立牛奶樣品布氏桿菌套式ＰＣＲ檢測方法。該方法可直接從牛奶樣品中檢出污染布氏桿菌，對牛奶樣品中布氏桿菌的檢測下限達３．３ＣＦＵ／ｍＬ，與大腸桿菌、溶血性鏈球菌、沙門氏菌、克雷伯氏桿菌、金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌和螺旋桿菌等細菌不存在非特異擴增，具有特異性強、敏感性高和實用性強等優(yōu)點，可為奶牛布氏桿菌病普查和監(jiān)測，以及牛奶制品食品安全監(jiān)控提供新的技術(shù)手段。

【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】

本專利技術(shù)屬于生物
，涉及基因工程技術(shù)，具體為牛奶樣品布氏桿菌的套式PCR檢 測方法。
技術(shù)介紹
布氏桿菌病(3^^// ^)又稱馬爾他熱或波狀熱，是由布氏桿菌屬(5^"http://"引起的人畜共 患的自然疫源性傳染病，對人類健康和畜牧業(yè)生產(chǎn)都有嚴重危害，1859年由Morston首次報 道。布氏桿菌可感染人類、多種家畜和野生動物，引起相似的臨床癥狀與病理損傷，如發(fā)熱、 流產(chǎn)與不育、慢性關(guān)節(jié)炎及神經(jīng)損害等，可導(dǎo)致巨大的經(jīng)濟損失和嚴重的公共衛(wèi)生問題。家 畜布氏桿菌病常發(fā)于豬、羊和牛，是人類布氏桿病的主要傳染源。布氏桿菌傳染性強、傳播 迅速，世界動物衛(wèi)生組織(OIE)將其列為B類動物疫病，我國列為二類動物疫病。1995年以 來，我國人畜布氏桿菌疫情明顯回升，2000年以后開始呈快速增長趨勢，局部地區(qū)甚至出現(xiàn) 爆發(fā)，衛(wèi)生部統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示1994年布病新發(fā)病人數(shù)為815人，發(fā)病率0.05/10萬，到2005年 新發(fā)病人數(shù)已經(jīng)接近2萬人，發(fā)病率高達1.41/10萬，比2004年增加60.2%，疫情形勢十分 嚴峻。布氏桿菌病是國際貿(mào)易檢疫中必檢的傳染病，我國每年均開展對奶牛的布氏桿菌病的普 査和監(jiān)控。目前，我國所采用的布氏桿菌檢測技術(shù)包括虎紅平板凝集試驗(RBT)、試管凝集試 驗(SAT)和補體結(jié)合試驗(CFT)等，均不能適應(yīng)現(xiàn)代檢驗檢疫需求。RBT和SAT等凝集試驗雖 然操作簡便、耗時短，但存在假陽性反應(yīng)，OIE已取消其作為布氏桿菌病的檢測方法；CFT 則操作繁瑣，實驗條件和技術(shù)水平要求高，無法在基層單位開展。因此，迫切需要建立新型 的快捷、簡便的檢測方法。酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)具有很高的特異性和敏感性，用于檢測 布氏桿菌特異性抗體，但不能將疫苗免疫與致病菌感染的抗體相區(qū)別。在病原檢測方面，針 對布氏桿菌保守基因(如BCSP31、 16S rRNA)的PCR檢測方法相繼建立，但多限于對布氏桿 菌純培養(yǎng)物或提純?nèi)旧wDNA的實驗室檢測，并顯示不同的敏感性(20-100 CFU/mL或8 fg-20 pg)，尚未建立對臨床樣品(特別是牛奶及其制品)的檢測技術(shù)，遠不能滿足動物布氏桿菌病檢 驗檢疫和監(jiān)控的實際需求。由于牛奶及其制品中存在大量乳脂和蛋白質(zhì)等多種非特異性影響 因素，嚴重影響牛奶樣品細菌染色體DNA的提取效率，因此直接從牛奶樣品檢測布氏桿菌 DNA存在較大難度。
技術(shù)實現(xiàn)思路
本專利技術(shù)的目的是提供直接從牛奶樣品中直接檢測布氏桿菌的套式PCR檢測方法，為奶牛 布氏桿菌病普査和監(jiān)測，以及牛奶制品的食品安全監(jiān)控提供新的技術(shù)手段。本專利技術(shù)所建立的牛奶樣品布氏桿菌套式PCR檢測方法，可以套式PCR引物直接從牛奶 樣品中檢測布氏桿菌特異性DNA片段。用3.4n/。十二垸基磺酸鈉(SDS)裂解牛奶樣品沉淀，經(jīng)1 mg/mL蛋白酶K和RNaseA消化， 以優(yōu)化的CTAB-NaCl法提取牛奶樣品細菌染色體DNA，以套式PCR引物直接從牛奶樣品中 檢測布氏桿菌特異性DNA片段。套式PCR引物的外向引物為 5'-TCGAGCGCCCGCAAGGGG-3，和5'-AACCATAGTGTCTCCACT AA-3'，內(nèi)向引物為 5'-ATCGGCAAATGATCGGCC-3，和5'-TACTCCCCAGGCGGAATG TT-3'，分別擴增903 bp 和628 bp布氏桿菌16S rRNA特異性DNA片段。本專利技術(shù)的詳細步驟如下(1) 將牛奶樣品沉淀用NET溶液懸浮，在懸浮液中加入10。/。十二烷基磺酸鈉(SDS)， 至終濃度為SDS重量占懸浮液體積的3.4o/。(w/v),裂解牛奶樣品沉淀，獲牛奶 樣品裂解液；(2) 在每毫升牛奶樣品裂解液中加入1毫克蛋白酶K和1毫克RNaseA消化，獲牛 奶樣品裂解消化液；(3) 以CTAB-NaCl法從牛奶樣品裂解消化液中提取牛奶樣品細菌染色體DNA;(4) 用套式PCR引物直接從牛奶樣品細菌染色體DNA中檢測布氏桿菌特異性DNA 片段。套式 PCR 引物的夕卜向引物為5，-TCGAGCGCCCGCAAGGGG-3，和 5，國AACCATAGTGTCTCCACT AA-3，，內(nèi)向引物為5'-ATCGGCAAATGATCGGCC-3'和 5，-TACTCCCCAGGCGGAATG TT-3'，分別擴增903 bp和628 bp布氏桿菌16S rRNA特異性 DNA片段。以上步驟(3)所述CTAB-NaCl法提取牛奶樣品細菌染色體DNA的具體步驟為在每 毫升牛奶樣品裂解消化液中加入5M的NaCl溶液0.14毫升，混合后加入含10%十六烷基三 甲基溴化銨(CTAB )和0.7 M NaCl的預(yù)熱至65°C的CTAB-NaCl水溶液，使CTAB在提取 液中的終濃度的重量體積比為CTAB 3.4%(w/v)， NaCl在提取液中的終濃度為0.7M;再 經(jīng)氯仿抽提和異丙醇沉淀，沉淀物用超純水溶解，獲牛奶樣品細菌染色體DNA。本專利技術(shù)具體敘述如下1、 根據(jù)布氏桿菌16S rRNA基因序列，設(shè)計合成布氏桿菌套式PCR的外向引物 5'-TCGAGCGCCCGCAAGGGG-3'和5'-AACCATAGTGTCTCCACT AA-3，，以及內(nèi)向引物 5，-ATCGGCAAATGATCGGCC -3，和5，-TACTCCCCAGGCG GAATGTT-3，，分別擴增903 bp 和628 bp布氏桿菌16S rRNA特異性DNA片段。2、 離心新鮮牛奶，取牛奶樣品沉淀用NET溶液懸浮，用3.4e/。十二烷基磺酸鈉(SDS) 裂解，經(jīng)1 mg/mL蛋白酶K和RNaseA消化，力口5MNaCl溶液，混后加入含10%十六烷基三 甲基溴化銨(CTAB)和0.7 M NaCl的CTAB-NaCl溶液(CTAB和NaCl終濃度為3.4%禾卩0.7M) 處理牛奶樣品裂解液，經(jīng)氯仿抽提和異丙醇沉淀，以超純水溶解DNA，用于套式PCR檢測。3、 初次PCR反應(yīng)體系為10xPCR Buffer (含Mg" 2.5 |iL、 2.5 mM dNTP 0.5 pL、外 向引物(12mM)各0.5pL、 Taq酶0.15nL、細菌染色體DNA 5 ^L，超純水15.85 擴增 程序為95 。C預(yù)變性2 min， 94 。C變性30 sec、 55。C退火30 sec、 72 。C延伸1 min，共30個 循環(huán)，最后72 。C延伸1 min。4、 二次PCR反應(yīng)體系為1 OxPCR Buffer (含Mg2+) 2.5 ^L、 2.5 mMdNTP 0,5 nL、內(nèi) 向引物(12 mM)各0.5 ^L、 Taq酶0.15 pL、初次PCR產(chǎn)物1 ^L,超純水19.85 擴增程 序為95。C預(yù)變性2min, 94 。C變性30 sec、 55。C退火30 sec、 72 。C延伸1 min,共20個循 環(huán)，最后72 i:延伸lmin。5、 PCR產(chǎn)物以1%瓊脂糖凝膠電泳檢查，觀察903 bp或628 bp的初次、二次擴增條帶。本專利技術(shù)的優(yōu)點是(1)本專利技術(shù)提供的套式PCR檢測方法特異性強，有效擴增出牛奶中污 染布氏桿菌16S rRNA的特異性DNA片段，與大腸桿菌、溶血性鏈球菌、沙門氏菌、克雷伯 氏桿菌、金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌和螺旋桿菌等本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護點】
一種牛奶樣品布氏桿菌套式ＰＣＲ檢測方法，其特征在于以下步驟：（１）將牛奶樣品沉淀用ＮＥＴ溶液懸浮，在懸浮液中加入１０％十二烷基磺酸鈉（ＳＤＳ），至ＳＤＳ在懸浮液的終濃度的重量體積比為３．４％，裂解牛奶樣品沉淀，獲牛奶樣品裂解液；（２）在每毫升牛奶樣品裂解液中加入１毫克蛋白酶Ｋ和１毫克ＲＮａｓｅＡ消化，獲牛奶樣品裂解消化液；（３）以ＣＴＡＢ－ＮａＣｌ法從牛奶樣品裂解消化液中提取牛奶樣品細菌染色體ＤＮＡ；（４）用套式ＰＣＲ引物直接從牛奶樣品細菌染色體ＤＮＡ中檢測布氏桿菌特異性ＤＮＡ片段。

【技術(shù)特征摘要】

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：周繼勇，郭軍慶，杜振昆，
申請(專利權(quán))人：浙江大學(xué)，
類型：發(fā)明
國別省市：86[中國|杭州]