一種基于選擇性探針的多重PCR方法及其應用技術

本發明專利技術涉及核酸擴增，具體涉及一種可同時擴增多個核酸片段的基于選擇性探針的多重ＰＣＲ方法及其應用。本發明專利技術所述的多重ＰＣＲ方法包括以下步驟：（１）構建選擇性探針；（２）延伸－連接反應；（３）ＰＣＲ擴增；（４）檢測ＰＣＲ擴增產物。其關鍵特征是反應體系中使用了選擇性探針，并且，ＰＣＲ擴增產物可存在長度的差異。該方法不但使分析通量大大提高，還可節省待檢樣本的核酸模板用量。與傳統的使用多對引物的多重ＰＣＲ技術相比，本發明專利技術的方法僅使用一對通用引物，但在理論上可至少同時擴增上千個靶核酸序列，具有操作簡便、通量大、檢測系統兼容性高等顯著優點。

【技術實現步驟摘要】

【技術保護點】
一種基于選擇性探針的多重ＰＣＲ方法，其特征是，包括以下步驟：　　　　（１）構建選擇性探針：　　　　選擇性探針的５’－端和３’－端分別設置一個與靶雙鏈核酸序列的同一條核酸單鏈序列的５’－和３’－端或者靶單鏈核酸序列的５’－端和３’－端互補的互補區，兩個互補區的中間部分設置為兩個通用序列區；通用序列區與互補區直接相連，或者通過標簽序列相連接；兩個通用序列區直接相連，或者中間設置一個尿嘧啶區，通過尿嘧啶區的尿嘧啶寡核苷酸相連；　　　　（２）延伸－連接反應：　　　　將下列物質混合，進行延伸－連接反應：　　　　①起始核酸模板；　　　　②步驟（１）所構建的選擇性探針；　　　　③四種三磷酸脫氧核糖核苷酸，包括ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ和ｄＧＴＰ；　　　　④ＤＮＡ連接酶和ＤＮＡ聚合酶，及其相應的緩沖液體系；或者，逆轉錄酶和ＤＮＡ聚合酶，及其相應的緩沖液體系；　　　　（３）ＰＣＲ擴增：　　　　其中反應物包括：延伸－連接反應產物、與選擇性探針的通用序列對應的一對通用引物、四種三磷酸脫氧核糖核苷酸（ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ和ｄＧＴＰ）、ＤＮＡ聚合酶及其相應的緩沖液體系；所述的一對通用引物，其中，一條通用引物與選擇性探針的一個通用序列區的序列相同，另一條通用引物則與選擇性探針另一個通用序列區的序列互補；　　　　（４）檢測ＰＣＲ擴增產物，以確定待檢樣本中是否存在靶核酸和／或靶核酸的拷貝數。...

【技術特征摘要】

【專利技術屬性】
技術研發人員：黃慶，府偉靈，王玨，黃君富，
申請(專利權)人：中國人民解放軍第三軍醫大學第一附屬醫院，
類型：發明
國別省市：85[中國|重慶]