本發(fā)明專利技術(shù)提供的是一種牛奶中致瀉性大腸桿菌ＰＣＲ快速檢測試劑盒及其制備方法。試劑盒的組成包括：１０×ＰＣＲ ｂｕｆｆｅｒ：５．０μｌ、１０ｍＭ ｄＮＴＰ：１．０μｌ、２５ｍＭ ＭｇＣｌ↓［２］：３．０μｌ、終濃度各１、０．５、１ｕＭ引物Ｐ１（ｅａｅＡ、ｉｐａＨ、ＳＴ）各：１．０μｌ、終濃度各１、０．５、１ｕＭ引物Ｐ２（ｅａｅＡ、ｉｐａＨ、ＳＴ）各：１．０μｌ、ＤＮＡ模板：５．０μｌ、ｄｄＨ↓［２］Ｏ：２９．５μｌ、ＴａｑＤＮＡ聚合酶（５Ｕ／Ｌｌ）：０．５μｌ、Ｔｏｔａｌ：５０．０μｌ。ＰＣＲ反應(yīng)條件為：９５℃預(yù)變性５ｍｉｎ；９４℃變性４０ｓ，５１．３℃退火４０ｓ，７２℃延伸１ｍｉｎ，進行３０個循環(huán)；７２℃延伸１０ｍｉｎ。本發(fā)明專利技術(shù)具有檢測速度快、檢出率高、靈敏度高等優(yōu)點。
【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)涉及的是一種生物監(jiān)測技術(shù)。
技術(shù)介紹
大腸埃希氏菌是流行性兼性厭氧菌，寄生在人類的結(jié)腸部位，是嬰兒出生一小時內(nèi)在胃腸道定居的典型微生物。其后，大腸埃希氏菌通常與其宿主保持共生關(guān)系。大腸埃希氏菌在正常情況下被局限在狹窄的腸道內(nèi)不致病，但是當(dāng)宿主過度疲勞或免疫力下降時，或當(dāng)正常胃腸道壁被破壞時。以致正常“良性”大腸埃希氏菌株也可引起感染。致瀉性大腸埃希氏菌是引起感染性腹瀉的病原菌之一。目前，根據(jù)致瀉性大腸埃希氏菌的毒力因子，致病機理及其遺傳控制，國際上將其分為五類——腸致病性大腸埃希氏菌(EPEC)、腸出血性大腸埃希氏菌(EHEC)、腸侵襲性大腸埃希氏菌(EIEC)、腸產(chǎn)毒性大腸埃希氏菌(ETEC)、腸集聚性大腸埃希氏菌(EAggEC)，其中ETEC菌株通過LT和ST致病基因的作用引起腹瀉。這些菌株可只表達(dá)LT。或只表達(dá)ST，或二者都表達(dá)。本實驗中的所采用標(biāo)準(zhǔn)菌株44247(ETEC，O6:K15:H16)被Jav Sarantuya等人報道只含ST。EPEC是在發(fā)展中國家已被同嬰兒腹瀉聯(lián)系在一起的一種重要的致腹瀉大腸桿菌分類，其致病性與LEE毒力島上的eaeA毒力基因有關(guān)。EIEC的侵襲機制是研究最為清楚的，其侵襲性是因為具有侵襲性質(zhì)粒引起的，在侵襲性質(zhì)粒上含有ipaH毒素基岡。目前采用的檢測食品中這幾種致瀉型大腸桿菌的分離培養(yǎng)法陽性率低。且費時費力，需幾周時間才能報告結(jié)果。近年來發(fā)展起來的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)檢測技術(shù)具有減少檢驗時間、方法簡單的優(yōu)點，為大腸桿菌的快速檢測提供了有力手段，但目前尚無同時檢測幾種腹瀉致病菌的方法。 專利
技術(shù)實現(xiàn)思路
本專利技術(shù)的目的在于提供一種分別以ST、eaeA、ipaH毒素基因為目的基因設(shè)計引物。應(yīng)用多重PCR同時擴增主要致病性大腸桿菌EPEC、EIEC和ETEC的毒力基因，建立一種牛奶中致瀉型大腸桿菌PCR快速檢測試劑盒。 本專利技術(shù)的目的是這樣實現(xiàn)的 多重PCR快速檢測試劑盒的組成包括 10×PCR buffer 5.0μl 10mM dNTP 1.0μl 25mM MgCI33.0μl DNA模板5.0μl ddH2O29.5μl Taq DNA聚合酶(5U/L1) 0.5μl Total50.0μl 本專利技術(shù)的檢測試劑盒還可以包括這樣一些特征 1、所述的引物的濃度為 2、所述的模板DNA，是將樣品或(ETEC、EPEC和EIEC)標(biāo)準(zhǔn)菌株混合物分別接種于LB，即10％蛋白胨、5％酵母提取物、10％氯化鈉，pH7.5的液體培養(yǎng)基中。200rpm/min、37±1℃搖床培養(yǎng)2.5h，采取裂解法或者試劑盒方法提取提取的DNA。 3、PCR反應(yīng)條件為 95℃ 5min； 94℃ 40S，51.3℃ 40S，72℃ 1min，循環(huán)30次，再72℃延伸1Omin。 本專利技術(shù)的檢測試劑盒是采用這樣的方法來制備的 1、細(xì)菌的增菌培養(yǎng) 將ETEC、EPEC和EIEC標(biāo)準(zhǔn)菌株分別接種于LB，即10％蛋白胨、5％酵母提取物、10％氯化鈉，pH7.5的液體培養(yǎng)基中，37℃過夜培養(yǎng)。 2、模板DNA的提取及定量 采取裂解法或者試劑盒方法提取提取DNA,應(yīng)用紫外可見分光光度計檢測DNA的吸光值，先用去離子水洗4次石英比色皿，將提取的原DNA用去離子水稀釋60倍。將3000μl去離子水的比色杯放入儀器中讀取零值作參照。將稀釋60倍后的DNA液加入到石英比色皿中上機檢測，根據(jù)公式核酸(μg/ml)＝62.9×A260-36×A280計算DNA濃度將過夜培養(yǎng)的菌液做10倍遞增稀釋，選擇2-3個適宜稀釋度。吸取該稀釋度1ml稀釋液于滅菌平皿內(nèi)。每個稀釋度做兩個平皿，及時將涼至46℃營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基注入平皿10-15ml，同時將營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基傾入加有1ml稀釋液的滅菌平皿內(nèi)作空白對照，待瓊脂凝固后，翻轉(zhuǎn)平板。置36±1℃溫箱內(nèi)培養(yǎng)48±2h，按照中國人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢測菌落總數(shù)測定(GB4789.2-94)進行菌落計數(shù)； 3、引物的設(shè)計與合成 引物序列、擴增片段長度 4、建立單個PCR反應(yīng)體系 PCR反應(yīng)在0.5ml Eppendorf管中進行，采用50μl反應(yīng)體系，各反應(yīng)成分為 10×PCR buffer 5.0μl 10mM dNTP 1.0μl 25mM MgCI3 3.0μl 引物P1 1.0μl 引物P2 1.0μl DNA模板 5.0μl ddH2O 33.5μl TaqDNA聚合酶(5U/Ll) 0.5μl Total 50.0μl 引物濃度為 5、本專利技術(shù)的多重PCR反應(yīng)條件為 95℃預(yù)變性5min；94℃變性40s，51.3℃退火40s，72℃延伸1min，進行30個循環(huán)；72℃延伸10min。 使用時取0.5ml奶樣加到4.5ml LB液體培養(yǎng)基中，200rpm/min、37±1℃搖床培養(yǎng)2.5h，取36μl LB培養(yǎng)液，加入到1.5ml離心管中，在加入4μl的10×TE和60μl的2×蛋白酶K，56℃金屬浴90min，95℃水浴10min，10,000×g離心1min，取上清做模板，制成試樣，-20℃保存?zhèn)溆谩０凑誔CR快速檢測試劑盒反應(yīng)體系的組成，即10×PCRbuffer 5.0μl；10mMdNTP 1.0μl；25mM MgCl2 3.0μl；引物P1各1.0μl；引物P2各1.0μl；DNA模板5.0μl；TaqDNA聚合酶(5U/Ll)0.5μl，其余用超純水加至反應(yīng)總體積為50.0μl。進行PCR擴增，95℃預(yù)變性5min；94℃變性40s，51.3℃退火40s，72℃延伸1min，進行30個循環(huán)；72℃延伸10min。再進行結(jié)果判定將50×TAE電泳緩沖液20ml加雙蒸水稀釋至1000ml(1×TAE)待用，14ml 1×TAE緩沖液于三角瓶中，加入3.5g瓊脂糖加熱溶解，冷至50℃左右后加入溴化乙錠(0.5μg/ml)0.5μl，倒人準(zhǔn)備好的電泳平板上，電泳槽中加入1×TAE緩沖液，取PCR終產(chǎn)物按5∶1的比例加入溴酚藍(lán)點樣110V電泳25min，取出然后置于300nm的紫外透射儀上觀察，樣品出現(xiàn)和陽性對照在同一水平位置上的紅橙色熒光帶即為陽性，否則為陰性。 本專利技術(shù)的原理為 致瀉性E.coli通過本身的致病基因引起腹瀉，如ETEC菌株通過LT和ST致病基因致病。這些菌株可只表達(dá)LT，或只表達(dá)ST，或二者都表達(dá)。EPEC的致病性與LEE毒力島上的eaeA毒力基因有關(guān)。EIEC的侵襲機制是研究最為清楚的，其侵襲性是因為具有侵襲性質(zhì)粒引起的，在侵襲性質(zhì)粒上含有ipaH毒素基因。本專利技術(shù)分別以ST、eaeA、ipaH毒素基因為目的基因設(shè)計引物，進行PCR擴增，證明這三對基因?qū)ο鄳?yīng)致病菌是特異性的，且敏感性很高。所以，應(yīng)用多重PCR技術(shù)在一次反應(yīng)中同時擴增主要致病性大腸桿菌EPEC、EIEC和ETEC的毒力基因，以建立一種快速檢測牛奶中致瀉性大腸桿菌的PCR擴增方法。 本專利技術(shù)對牛奶中常見的腹瀉致病性大腸桿菌即致病性大腸桿菌(EPEC)、產(chǎn)腸毒素大腸桿菌(ET本文檔來自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護點】
一種牛奶中致瀉性大腸桿菌ＰＣＲ快速檢測試劑盒，其特征是：其組成包括：１０×ＰＣＲｂｕｆｆｅｒ５．０μｌ１０ｍＭｄＮＴＰ１．０μｌ２５ｍＭＭｇＣｌ↓［２］ ３．０μｌ＊＊＊ＤＮＡ模板 即ＬＢ培養(yǎng)菌液提取的ＤＮＡ５．０μｌｄｄＨ↓［２］Ｏ２９．５μｌＴａｑＤＮＡ聚合酶（５Ｕ／Ｌｌ）０．５μｌＴｏｔａｌ５０．０μｌ。
【技術(shù)特征摘要】
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：李繼昌，霍貴成，張鐵男，
申請(專利權(quán))人：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)，
類型：發(fā)明
國別省市：93[中國|哈爾濱]
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