代謝控制的工程化制造技術

本發明專利技術特征在于在代謝物和代謝通量的調控下在細胞中生產異源分子的方法，所述方法可增加異源多肽和代謝物的合成。（*該技術在2020年保護過期，可自由使用*）

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及代謝控制的工程化，更具體地涉及工程化的宿主細胞，其可以增加異源多肽和代謝物的產量，本專利技術還涉及在宿主細胞中生產異源多肽和代謝物的方法。
技術介紹
重組DNA技術的應用使得可工程化宿主細胞，以產生所需的化合物，如多肽和次生代謝物。在工程細胞中大規模生產多肽使得可生產具有藥學用途的蛋白質和具有工業用途的酶。次生代謝物是來自自然界的產物，長久以來已知其生物學和醫學重要性。由于這種分子固有的結構復雜性，傳統的化學合成通常需要大量人力并使用昂貴的前體和輔因子以制備該化合物。近年來，在細胞中表達異源蛋白已經促進在生物中異源生物合成途徑的工程化，以從非昂貴的起始材料生產代謝物。以此方式，已產生了許多化合物，包括聚酮化合物，β-內酰胺抗生素，單萜，類固醇，和芳香化合物。
技術實現思路
本專利技術部分基于如下發現，即可通過使用受次生代謝物如乙酰磷酸濃度調節的啟動子調節多肽(如生物合成酶)的表達，而增加異源多肽和代謝物的產生。術語“異源”是指多肽或代謝物是通過人為導入的。異源多肽或代謝物可與天然存在的內源性物質相同。術語“代謝物”指是一或多個生物化學反應的產物的有機化合物。代謝物其自身可以是其它反應的前體。次生代謝物是產生自另一代謝物的代謝物。因此本專利技術一方面涉及一種含有一核酸序列的細菌宿主細胞，該核酸序列包含一個啟動子和一個編碼異源多肽的核酸序列。細菌宿主細胞例如包括大腸桿菌，枯草芽孢桿菌，鼠傷寒沙門氏菌，根瘤土壤桿菌，嗜熱水生菌，和豌豆根瘤菌細胞。此核酸序列可操縱地與由應答調節蛋白控制的啟動子連接。換而言之，核酸序列與啟動子的連接方式是使核苷酸序列在體外或體內表達。“啟動子”是指導遺傳物質轉錄的任何DNA片段。啟動子是由應答調節蛋白控制的，例如大腸桿菌的ntrC，phoB，phoP，ompR，cheY，creB，或torB，或其它細菌菌種的同源物。另外，應答調節蛋白可以是簇合直向同源組(cluster orthologous group，COG)COG0745的另一成員，其由http://www.ncbi.nlm.nih.gov/COG/所定義(Tatusov等，核酸研究(2000)；2833-36)。在一實施方案中，啟動子是與大腸桿菌ntrC結合的。術語“ntrC”是指大腸桿菌ntrC蛋白(SWISSPROTP06713，http://www.expasy.ch/)及在其它適當細菌中的同源物。本文所用“結合”是指平衡結合常數(KD)小于100nM，優選小于lnM的物理締合作用。一適當的啟動子例如是大腸桿菌glnAp2啟動子，如以GenBank登記號No.M10421公布的DNA序列的大約93-323位之間的區域(Reitzer & Magasanik(1985)美國科學院院報821979-1983)。此區域包括glnA基因的未翻譯序列。另外，可在glnA編碼序列和異源多肽的編碼序列之間構建一翻譯融合體。宿主細胞被遺傳修飾從而啟動子由乙酰磷酸在無氮饑餓的情況下調節。例如，宿主細胞可通過缺失或突變編碼組氨酸蛋白激酶的基因而遺傳修飾，例如，該組氨酸蛋白激酶是COG0642的成員(如由http://www.ncbi.nlm.nih.gov/COG/所述；Tatusov等，如前)，例如glnL，phoR，phoQ，creC，或envZ。在另一實施例中，組氨酸蛋白激酶對控制啟動子的應答調節蛋白有特異性。組氨酸蛋白激酶可由glnL，如大腸桿菌glnL(SWISSPROT P06712，http://www.expasy.ch/)編碼。盡管宿主細胞被遺傳修飾從而啟動子由乙酰磷酸在無氮饑餓的情況下調節，以表達異源多肽或代謝物，但宿主細胞可在任何所需條件下繁殖，例如在氮饑餓條件，氮缺乏條件，或氮富足條件下繁殖。由此核酸序列編碼的異源多肽可以是產生代謝物所需的生物合成酶，其可以是哺乳動物蛋白，例如分泌的生長因子，單克隆抗體，或胞外基質組分。在另一實施例中，異源多肽可以是用于疫苗中的所需抗原，例如來自病毒，細菌，真菌或原生動物病原體的表面蛋白。本專利技術的另一方面涉及一種試劑盒，其含有一種核酸序列，該核酸序列包括由應答調節蛋白控制的啟動子。此試劑盒還任選的含有已經遺傳修飾的細菌宿主細胞，從而啟動子在不存在氮饑餓情況下由乙酰磷酸調節。此試劑盒還可提供使用說明。所述核酸序列可含有位于啟動子3’端的限制酶多接頭，這樣插入多接頭的序列與由應答調節蛋白控制的啟動子可操縱地連接。在該試劑盒的一實施方案中，啟動子是大腸桿菌glnAp2啟動子，細菌宿主細胞是含有glnL基因缺失或突變的大腸桿菌細胞。本專利技術另一方面涉及含有第一個表達盒的宿主細胞。第一個表達盒包括啟動子，如上述那些啟動子，以及編碼異源代謝物生物合成所需的酶的核酸序列。本文所用術語“酶”是指具有催化一個化學反應或多個反應的能力的多肽。所述核酸序列可操縱地與啟動子連接，該啟動子在無氮饑餓情況下由乙酰磷酸調節。宿主細胞還含有表達代謝物生物合成所需的其它酶的另外的核酸序列。這種另外的核酸序列可以是表達內源酶的內源序列，或表達異源酶的導入的序列。在一實施例中，異源代謝物是類異戊二烯，多羥基鏈烷酸酯，聚酮化合物，β-內酰胺抗生素，芳香化合物，或其前體，例如上游代謝物，或其衍生物，例如下游代謝物。例如，類異戊二烯可以是類胡蘿卜素，固醇，紫杉醇，二萜，赤霉素，和醌。類異戊二烯的特別例子包括二磷酸異戊酯，二磷酸二甲基烯丙酯，二磷酸香葉酯，二磷酸法呢酯，二磷酸香葉基香葉酯，和八氫番茄紅素。類胡蘿卜素特別例子包括β-胡蘿卜素，ζ-胡蘿卜素，蝦青素，玉米黃質，玉米黃質-β-葡糖苷，六氫番茄紅素，鏈孢紅素，葉黃素和torulene。當所需的異源代謝物是類異戊二烯時，異源酶可以是異戊烯二磷酸異構酶，二磷酸香葉基香葉酯合酶，或1-脫氧木酮糖-5-磷酸合酶。當所需的異源代謝物是多羥基鏈烷酸酯時，異源酶可以是3-酮酯酰還原酶，或聚-3-羥基鏈烷酸酯聚合醇。宿主細胞可以是細菌細胞，例如大腸桿菌細胞。此宿主細胞任選地通過缺失或突變一個基因而遺傳修飾，該基因例如是上述編碼組氨酸蛋白激酶的基因。在一特異的實施例中，宿主細胞還含有第二個表達盒，其含有與受乙酰磷酸濃度調節的啟動子如glnAp2可操縱連接的編碼烯醇丙酮酸磷酸合酶的核酸序列。本專利技術另一方面涉及一種在宿主細胞中生產異源類異戊二烯的方法。該方法包括過表達烯醇丙酮酸磷酸合酶，和表達異源類異戊二烯合成所需的生物合成酶。在一實施方案中，在宿主細胞中編碼丙酮酸激酶或烯醇丙酮酸磷酸羧化酶的基因經遺傳缺失或弱化。在另一實施方案中，編碼烯醇丙酮酸磷酸羧激酶的基因在宿主細胞中過表達。本專利技術的另一方面涉及一種在宿主細胞中生產番茄紅素的方法，此方法包括表達以下異源酶1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶，二磷酸香葉基香葉酯合酶，八氫番茄紅素合酶，和八氫番茄紅素飽和酶。在此方法的一實施方案中，異戊烯二磷酸異構酶例如使用glnAp2啟動子而過表達。本專利技術的另一方面涉及一種核酸序列，其含有一個啟動子和編碼產生第一種代謝物所需的生物合成酶的序列。該啟動子可操縱地與該序列連接，并由第二種代謝物調節，該第二種代謝物的濃度是生物合成第一種代謝物的前體的可用性的指示。在一實施例中，第二本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種包含一核酸序列的細菌宿主細胞，該核酸序列包含一個啟動子和一編碼異源多肽的核酸序列；所述核酸序列可操縱地與由應答調節蛋白控制的啟動子相連；該宿主細胞經遺傳修飾從而啟動子在不存在氮饑餓的情況下由乙酰磷酸誘導／激活。

【技術特征摘要】
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【專利技術屬性】
技術研發人員：詹姆斯C廖，
申請(專利權)人：食品工業發展研究所，
類型：發明
國別省市：71[中國|臺灣]