導電微孔板制造技術

本發明專利技術描述了一種用于檢測樣品中靶生物分子的導電微孔板設備（１５）。微孔板（１５）含有多孔基底（１）和導電層（２）的裝配件，其中的裝配件密封入微孔板（１５）的至少幾個孔底部。多孔基底（１）具有頂面（３）和底面。頂面（３）含有多個共價連接的探針生物分子。共價連接的探針生物分子與樣品中含有的靶生物分子具有反應活性。連接至多孔基底（１）底面的導電層（２）能適于承受電壓。本發明專利技術的微孔板可容易地適于機器人工作站采用。相應地，在一個實施方案中，電源合并入機器人手臂工具內，以用于快速的微孔板處理。（*該技術在2023年保護過期，可自由使用*）

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及用于同時進行多個分析的設備。具體地，本專利技術涉及含有活性電極的微孔板設備，以用于吸引生物分子靶分析物。本專利技術還涉及制造和使用該設備的方法。現有技術的描述多個現代分子生物學方法，包括核酸雜交分析和蛋白質結合分析，采用探針生物分子(“探針”)的“生物芯片”或陣列以結合和檢測復雜樣品體系中的靶生物物質(“靶”)。這些方法中，最通常地只是將某種樣品置于陣列表面上，樣品中含有的靶被動地朝固定于支持物上的探針擴散并與之結合。采用被動擴散原理的市售微陣列實例包括Affymetrix(Santa Clara，California)公司生產的GENECHIP陣列，以及Synteni(Fremont，CA)公司生產的GEMTM陣列。雖然這種陣列處理高體積和高目標物含量的樣品時有效，然而在低目標濃度的樣品中其擴散是有限的。用戶對付這種局限性采用的典型方法是，將溫育時間延長至15-20小時或更長以俘獲低豐度靶，或在試驗前處理樣品以提高靶的濃度。例如，樣品中的靶DNA拷貝數可采用聚合酶鏈反應進行擴增。或者，可使用多個細胞以制備具有更高水平目標生物分子的樣品。然而，對于高通量和超高通量樣品處理而言，延長雜交時間存在嚴重的瓶頸。多個細胞群的使用會導致包括不代表目標生物分子的其他細胞類型的可能性增加。另外，擴增包括復雜且冗長的步驟，并且通過低豐度物質的過度擴增可引入顯著偏差。而且，由于引物-靶退火中的差別，并非所有物種都可以擴增至同樣的程度。因此，成本、方便性和靈活性限制了基于擴散的方法。近來，Nanogen，Inc.(San Diego，Ca)提出一種替代性的檢測樣品中低拷貝靶的方法(美國專利號5,605,662；5,632,957；5,965,452；5,849,486；5,929,208；6,017,696；6,048,690；6,051,380；6,225,059；6,287,517)。通過對陣列設備的特定區域提供電荷，迫使帶電靶生物分子朝該區域遷移并在該區域上集中。結果，與上面討論的被動擴散方法相比較，探針生物分子與靶生物分子更快速和有效地結合。由Nanogen開發的電子陣列設備典型地包括電流，電壓或電源，偶聯至電源的電極，在電極的一個表面上形成的滲透層，以及在滲透層上形成的生物連接層。滲透層為小抗衡離子在電極和溶液之間提供自由轉運，連接層則提供了特定結合實體的連接(美國專利號5,965,452)。這種電子陣列設備的其中一種可從市售獲得，商標名為NANOCHIPTM。雖然由Nanogen開發的電子陣列設備明顯改進了探針-靶結合速率，然而這些陣列并不能應用于高通量篩選(HTS)。Nanogen的電子陣列設備較為龐大、昂貴，并且難以控制。并且它們的探針生物分子密度非常有限，并且不能通常如HTS所需的每天處理數以千計的樣品。專利技術概述鑒于如上提及的傳統陣列體系的缺點，本專利技術的一個目的是提供廉價的陣列設備，用于快速和有效的結合未擴增或擴增的生物分子。尤其理想的是提供廉價的具有足夠高探針生物分子密度，并且適合用于HTS形式的樣品分析的陣列設備。本專利技術的另一目的是提供制造和使用這種陣列設備的方法。本專利技術中，通過采用導電微孔板設備用于樣品中靶生物分子的檢測，即可達到這些及其他目的。本專利技術的微孔板包括多孔基底的和導電層的裝配件，其中的裝配件密封入微孔板的至少是有一些孔的底部。多孔基底帶有頂面和底面。頂面含有多個共價連接的探針生物分子。共價連接的探針生物分子與樣品中含有的靶生物分子具有反應活性。連接至多孔基底底面的導電層適于接收電壓。在一個實施方案中，多孔基底的頂面進一步含有多個與探針生物分子具有反應活性的活化的官能側基。在此實施方案中，多個探針生物分子共價連接至官能側基。優選地，活化的官能側基是酰氟基。最優選地，探針生物分子連接在多孔基底頂面上的離散位置，由此形成陣列。本專利技術的另一方面包括一種設備，含有上述導電微孔板和用于給微孔板提供電壓的電源。本專利技術的微孔板可容易地適于機器人工作站。因此，在一個實施方案中，電源合并入機器人手臂的工具內，以用于進行快速的微孔板處理。本專利技術的另一方面涉及形成帶有多個孔的導電微孔板的方法。該方法含有如下步驟(a) 提供帶有頂面和底面的多孔基底；(b) 用可與探針生物分子共價連接的活性官能團活化頂面；(c) 在使探針生物分子充分共價連接至具有活性官能團的條件下，將頂面與探針生物分子接觸；(d) 將導電層連接至多孔基底的底面；以及(e) 將帶有連接的導電層的多孔基底密封入微孔板的至少是有一些孔的底部，其中的導電層適于接收電壓。另一方面，本專利技術提供了將靶生物分子雜交至探針生物分子的方法。該方法包括(a) 提供本專利技術的導電微孔板，其中的導電層形成第一電極，微孔板另外含有第二電極，所述第二電極通過電解質溶液與第一電極電接觸；(b) 將標記的靶生物分子引入電解質溶液中；以及(c) 在第一和第二電極之間施加電壓，由此標記的靶生物分子與多孔基底表面上的探針生物分子雜交。本專利技術呈現出很多勝于傳統設備的經濟和技術優勢。本專利技術以微孔板形式公開了生物分子靶的電泳濃縮。雖然微孔板印跡被廣泛接受作為HTS的標準形式，然而采用諸如NANOCHIPSTM的傳統微電子設備制造微孔板以增加靶結合速率將會極其昂貴而難以施行，尤其是當希望單純使用消耗性微孔板時。另一方面，本專利技術的微孔板通過活化廉價多孔導電基底并密封入微孔板的孔底部而得以構建。因而，本專利技術的導電微孔板提供了常規陣列設備的廉價、簡易并且可靠的選擇性替代。本專利技術的導電微孔板適合用于未擴增和擴增生物分子的快速和有效結合。例如，本專利技術的導電微孔板適合于諸多HTS應用中核酸的超快雜交至微陣列，所述HTS應用包括藥物開發和基于基因的診斷學。另外，在本專利技術的優選實施方案中，多孔基底采用酰氟基進行活化。本領域技術人員將會理解酰氟化學物的優點。酰氟基對與水的反應具有相對的抗性(“經由氨基酸氟化物的肽合成”，Carpino，L.，Beyerman，M.，Wenschuh，H.&Bienert，M.Acc.Chem.Res.29，268-74，1996)，而與氮和/或氧親核試劑則具有高反應活性。這種高反應活性及與含水條件下的穩定性相結合使得酰氟活化的化學性質對生物陣列應用具有特別吸引力，因為它在探針生物分子的固定前和固定后延長了保存期限。最后，酰氟活化的基底既可結合修飾的探針生物分子，也可結合未修飾的探針生物分子。由于并不需要修飾生物分子，基本上試劑成本的減少可達到50％。本專利技術的上述和其他特征，以及獲得它們的方式，通過參考如下描述并與附圖結合，可變得更明顯并能被最好的理解。這些附圖僅僅是描述本專利技術的典型實施方案，不應認為是對本專利技術范圍的限制。附圖描述附圖說明圖1描述電場中影響帶負電荷分子運動的受力。圖2a和2b所示為電動雜交(圖2b)勝于基于擴散的DNA/RNA雜交(圖2a)的優點。圖3所示為帶有導電層的多孔基底的裝配件。圖4所示為根據本專利技術一個實施方案的多孔基底、滲透層及密封入孔底部的導電層的裝配件。圖5所示為根據本專利技術一個實施方案的微孔板和熱板電源的裝配件。圖6所示為標記的cDNA靶與固定于活化的多孔膜基底上的cDNA探針的被動雜交。圖本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種用于檢測樣品中靶生物分子的導電微孔板，該微孔板具有多個孔，所述微孔板包括：多孔基底和導電層的裝配件，其中的裝配件密封入至少是有一些孔的底部，其中多孔基底具有頂面和底面，頂面包括多個共價連接的探針生物分子， 其中的探針生物分子對靶生物分子具有反應活性，導電層連接至多孔基底的底面，并且導電層適于接收電壓。

【技術特征摘要】
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【專利技術屬性】
技術研發人員：羅伯特S馬特森，
申請(專利權)人：貝克曼考爾特公司，
類型：發明
國別省市：US[美國]