一種男性不育癥的檢測方法技術

本發明專利技術關于一種男性不育癥的檢測方法及其檢測試劑的制備方法。其中檢測方法包括：制備含２－氯－４－硝基苯基－α－Ｄ－葡萄糖苷的酶活力檢測試劑液；制備精漿樣品，在測定的條件下進行酶促反應，檢測α－葡萄糖苷酶的活性。該檢測試劑的制備方法包括：制備五乙酰氧基葡萄糖苷；采用得到的五乙酰氧基葡萄糖苷制備２－氯－４－硝基苯基－α－四乙酰氧基葡萄糖苷；用２－氯－４－硝基苯基－α－四乙酰氧基葡萄糖苷制備２－氯－４－硝基苯基－α－Ｄ－葡萄糖苷；和取適量緩沖液固體、２－氯－４－硝基苯基－α－Ｄ－葡萄糖苷和還原型谷胱甘肽混合制成粉劑，并確定檢測方法，以適應儀器自動化分析。（*該技術在2023年保護過期，可自由使用*）

【技術實現步驟摘要】
【國外來華專利技術】
本專利技術關于，尤其是一種將α-葡萄糖苷酶試劑用于男性不育癥，特別是生精障礙與輸精障礙不育癥鑒別的的檢測方法及其檢測試劑的制備方法。
技術介紹
男性生殖健康的狀況直接關系到子孫后代的幸福與人類的生存和文明的延續，因而這已引起全社會的高度重視。目前，主要是通過常規精液檢查獲得如精液量、精子密度、活動力、活動度、存活率等臨床數據，來作為判斷是否患有男性不育癥的依據。現有的方法大致可分為目測估計、儀器測定和圖象輔助分析三大類。其中目測估計法主要是通過光學顯微鏡來觀測精子活動情況判斷精子的活動能力，其所得的檢測結果準確與否很大程度上取決于個人技術、認真程度、判斷能力和個人的工作經驗等因素，因此并不可靠。儀器測定法主要包括精子穿透實驗(即精子爬高實驗)和精子速度實驗兩種。其中精子穿透實驗是模擬精子活動的環境，測量玻璃毛細管內精子穿透高度、或測量精子實際穿透樣品卵細胞的情況來衡量精子運動能力，如美國專利第6,465,197號所揭示的檢測方法。以上檢測方法所給出的都是精子群體總的趨向的統計數據，不能定量地提供單個精子活動能力的有關參數。而實際臨床檢測發現往往有相當部分的精子貌似正常而其活動能力卻十分低下，也有精子數量偏低但仍具有生育能力的病例。因此，人們已經意識到定量檢測單個精子活動能力大小的重要性，中國專利申請第99108824.7號采用光鑷技術來進行定量檢測單個精子的活力，利用光鑷捕獲精液中的一個精子，將其束縛在液體中，然后降低激光輸入功率，改變光鑷對精子的作用力，直到精子憑自己的活動能力從光鑷中逃脫，此時逃逸顯示器上所顯示的數據，即為該精子的逃逸力；通過測定多個精子的逃逸力然后示其平均力，可得到多個精子的平均活動能力，即精子的活力。人們還發現精子細胞中含有的某些成分，如HspA2 chaperone蛋白、22KD蛋白、SP-22等，與男性生殖能力有很大關系，美國專利第6,197,940號和第6,541,206號等，即旨在檢測將精液中這些成分暴露在有毒或受污染環境下時，其相應的生殖能力的下降情況。其所采用的方法是將特定抗體施加到前述精液中的蛋白質上，則實驗精子對該抗體的認同程度可反映該實驗精子的生殖能力。另外，精液中的中性α-葡萄糖苷酶可選擇性參與催化糖原α-1，4-葡萄糖苷鍵的水解，供給精子代謝與運動的能量，對精子的成熟、獲能和受精具有重要的意義。α-葡萄糖苷酶的活力受性激素水平的影響，此酶由附睪分泌，是附睪的特異性酶和標記酶，可作為附睪的功能性指標。精漿中α-葡萄糖苷酶活性與精子活力呈正相關性，臨床上將酶活力檢測用于附睪原因不育癥的診斷，以及輸精管道阻塞性病變與睪丸生精障礙所致無精癥的鑒別。目前的α-葡萄糖苷酶試劑盒采用對硝基-苯基-α-D-葡萄糖苷作為酶反應底物，測定的色原是對硝基苯酚，其pKa值為7.15，摩爾吸光系數隨著pH值的升高而增大，需以堿性條件呈色。而中性α-葡萄糖苷酶最適反應條件是pH＜7.00，因此，利用對硝基-苯基-α-D-葡萄糖苷作底物，必須采用終點法終止反應并呈色，檢測方法煩瑣，不能適應儀器自動化批量分析；為提高靈敏度、準確度，還必須增大反應時間并設定空白對照，試劑用量大，測定時間長，且底物主要依賴進口，在性能、價格上限制了其推廣應用。
技術實現思路
本專利技術要解決的技術問題在于克服上述現有技術的不足，提供一種將α-葡萄糖苷酶試劑用于男性不育癥，尤其是生精障礙與輸精障礙不育癥鑒別的檢測方法及其檢測試劑的制備方法。本專利技術的技術要點是提供一種男性不育癥的檢測方法，包括以下步驟步驟一制備含2-氯-4-硝基苯基-α-D-葡萄糖苷的酶活力檢測試劑液；步驟二制備精漿樣品；步驟三取適量步驟一制得的酶活力檢測試劑液與步驟二制備的精漿混合，在適當的條件下進行酶促反應，據此測定α-葡萄糖苷酶的活性。步驟一包括取適量2-氯-4-硝基苯基-α-D-葡萄糖苷試劑粉劑溶于水，該試劑粉劑包含配制體積為100ml、濃度為100mmol/L、pH值為6.80的緩沖液所需的緩沖液固體，2-氯-4-硝基苯基-α-D-葡萄糖苷為0.49～0.88g，還原型谷胱甘肽為1.0～3.0mg。所述緩沖液固體可采用檸檬酸-檸檬酸氫鹽、磷酸二氫鹽-磷酸-氫鹽、酒石酸-酒石酸氫鹽等。步驟一還包括將所述試劑粉劑溶于水，定容100.0ml，作為分析液(低溫避光保存)。步驟二包括采集精液，在37℃溫度下放置30min，在2000轉/min的轉速下離心12min，得到所需精漿(-20℃保存)。步驟三包括取檢測試劑液1.5ml，精漿50ul，在37℃溫度下進行反應；并用自動生化分析儀根據檢測試劑液的吸光度的變化來測定α-葡萄糖苷酶的活性，反應檢測波長為2-氯-硝基苯酚的最大吸收波長402nm。步驟三還包括以標準α-葡萄糖苷酶進行校正，酶單位(IU/L)為每分鐘水解產生1μmol對硝基苯酚的酶的量，其正常參考范圍為41.1±20.3IU/L。本專利技術還提供一種用于上述男性不育癥的檢測方法的檢測試劑的制備方法，包括以下步驟步驟一制備五乙酰氧基葡萄糖苷；步驟二采用步驟一得到的五乙酰氧基葡萄糖苷制備2-氯-4-硝基苯基-α-四乙酰氧基葡萄糖苷；步驟三采用步驟二得到的2-氯-4-硝基苯基-α-四乙酰氧基葡萄糖苷制備2-氯-4-硝基苯基-α-D-葡萄糖苷。步驟一包括取適量的葡萄糖與過量的乙酸酐、無水乙酸鈉混合并加熱至90～100℃，攪拌反應30～60min，反應液充分攪拌并滴加堿液調節至pH值呈中性，除去乙酸，濾出五乙酰氧基葡萄糖苷固體。步驟一也可以是取適量的葡萄糖與過量的乙酰氯、硫酸混合并加熱至80～90℃，攪拌反應30～60min，反應液充分攪拌并滴加堿液調節至pH值呈中性，除去乙酸，濾出五乙酰氧基葡萄糖苷固體。步驟二包括取五乙酰氧基葡萄糖苷、2-氯-4-硝基苯酚、經灼燒的氯化鋅混合，油浴加熱溶解，高溫條件下充分攪拌。步驟二還包括將反應物以氯仿提取，用堿液洗去過量的2-氯-4-硝基苯酚，用無水硫酸鈉干燥，濃縮至干，再用無水乙醇結晶得到顆粒狀的2-氯-4-硝基苯基-α-四乙酰氧基葡萄糖苷晶體。步驟三包括將2-氯-4-硝基苯基-α-四乙酰氧基葡萄糖苷晶體溶于甲醇，滴加甲醇鈉甲醇溶液，攪拌，以TCL監測反應，至乙酰氧基完全水解，減壓濃縮至干。TCL監測反應采用的展開劑為3∶7的乙酸乙酯∶正己烷，完全水解后Rf＝0，再用甲醇重結晶。步驟三還包括以TCL檢測產物的構型和純度，所用的展開劑為4∶1的乙酸乙酯∶甲醇。α-糖苷較β-糖苷，其Rf值略高，產物TCL應為單點，下面無雜質。本專利技術檢測試劑的制備方法進一步包括步驟四取適量緩沖液固體、2-氯-4-硝基苯基-α-D-葡萄糖苷和還原型谷胱甘肽混合制成粉劑保存。所述緩沖液固體可采用檸檬酸-檸檬酸氫鹽、磷酸二氫鹽-磷酸-氫鹽、酒石酸-酒石酸氫鹽等。測定時，將粉劑配制成100.0ml溶液適用于50人份，成份為濃度為100mmol/L、pH值為6.80的緩沖液，2-氯-4-硝基苯基-α-D-葡萄糖苷為0.49～0.88g，還原型谷胱甘肽為1.0～3.0mg。本專利技術在底物糖苷的合成反應中，葡萄糖分子中的羥基經乙酰化保護后，再采用常規試劑氯化鋅催化成苷，可使糖部分脂溶性增加而加快成苷反應的速率，并減少低聚糖副產物的生成，從而本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種男性不育癥的檢測方法，包括以下步驟：步驟一：制備含２－氯－４－硝基苯基－α－Ｄ－葡萄糖苷的酶活力檢測試劑液；步驟二：制備精漿樣品；步驟三：取適量步驟一制得的酶活力檢測試劑液與步驟二制備的精漿樣品混合，在適當的條件 下進行反應，測定α－葡萄糖苷酶的活性。

【技術特征摘要】
【國外來華專利技術】

【專利技術屬性】
技術研發人員：張建華，徐汝明，陸陽，
申請(專利權)人：上海第二醫科大學，
類型：發明
國別省市：31[中國|上海]