應用胎兒臍血阻斷血友病A致病基因傳遞的方法技術

一種應用胎兒臍血阻斷血友病Ａ致病基因傳遞的方法，由以下步驟組成：　　　　（１）樣品制備：選擇有血友病Ａ（ＨＡ）家族史的女性于妊娠２０周后，在超聲引導下經皮抽取胎兒臍帶靜脈血０．９ｍｌ或１．８ｍｌ，立即與０．１ｍｌ或０．２ｍｌ３．８％枸櫞酸鈉抗凝劑混勻，同時以相同方法和用量抽取攜帶者及其丈夫和正常人外周靜脈血作對照；　　　　（２）離心：將上述樣品于４℃條件下，以２４００～２５００轉／分鐘離心２０～２５分鐘，取上層１／３～２／３血漿進行凝血因子Ⅷ活性（ＦⅧ∶Ｃ）和血管性血友病因子（ｖＷＦ）血清學的生化測定；取白細胞層提取ＤＮＡ進行ＰＣＲ聯合基因診斷；　　　　（３）篩選分型：依據上述測定的血漿凝血因子Ⅷ活性和血管性血友病因子濃度，確診血友病Ａ患者及其攜帶者，并根據血漿ＦⅧ∶Ｃ濃度將血友病Ａ患者分為重型ＨＡ，其ＦⅧ∶Ｃ＜１％；中型ＨＡ，其ＦⅧ∶Ｃ１％～５％；輕型ＨＡ，其ＦⅧ∶Ｃ５％～２５％、亞臨床型ＨＡ，其ＦⅧ∶Ｃ２５％～４５％；　　　　（４）直接基因診斷：應用長距離ＰＣＲ（ＬＤ－ＰＣＲ）技術對上述樣品提取的ＤＮＡ進行產前基因診斷，根據電泳條帶的大小和分子量的大小綜合判定患者是否存在ＦⅧ基因內含子２２倒位；若只出現１２Ｋｂ帶，判為野生型即非倒位；若只出現１１Ｋｂ帶，判為倒位患者；若出現１２Ｋｂ和１１Ｋｂ兩條帶，判為倒位的攜帶者；　　　　（５）阻斷ＨＡ致病基因傳遞：對于上述判為倒位的患者或判為倒位的攜帶者，應終止妊娠，切斷ＨＡ致病基因的傳遞；　　　　（６）間接基因診斷：對上述非倒位的重型ＨＡ、中型ＨＡ和輕型ＨＡ家系，依次采用Ｂｃｌ－Ｉ　　ＰＣＲ／ＲＦＬＰ分析技術、基因內含子１３（ＣＡ）ｎ及內含子２２（ＧＴ）ｎ（ＡＧ）ｎ二核苷酸重復序列多態性分析技術及與ＦⅧ基因緊密連鎖的可變串聯重復序列多態性分析技術（Ｓｔ１４／ＶＮＴＲ）進行間接基因診斷；　　　　（７）阻斷ＨＡ致病基因傳遞：步驟（６）依次進行的各步基因診斷中，當樣品判為ＨＡ患者或攜帶者時，終止妊娠，切斷ＨＡ致病基因的傳遞；未作的診斷步驟停止。（*該技術在2023年保護過期，可自由使用*）

【技術實現步驟摘要】
【國外來華專利技術】
本專利技術涉及一種臨床血液學和圍產醫學的技術方法，具體涉及一種應用胎兒臍血阻斷血友病A致病基因傳遞的方法。
技術介紹
血友病A(HA)是一種常見的X連鎖隱性遺傳性出血性疾病，女性為攜帶者，男性發病。HA患者的特征為自發性或輕微外傷后出血不止，患者終生需要輸注凝血因子VIII制品治療和預防出血，給家庭和社會帶來沉重的負擔。若得不到及時診斷和治療，患者可發生殘疾，極大地影響其生活質量，嚴重的出血可引起患者死亡。雖然目前HA不能根治，但該病是一種遺傳性疾病，醫學上可以通過遺傳學咨詢和產前診斷方法，起到預防作用，避免新的HA患者出現，從而達到從源頭上控制HA的目的。我國是人口大國，約13億人口，HA的發病率約為3-5人/10萬人口，為此開展HA的基因診斷、攜帶者檢測和產前診斷，阻斷致病基因的傳遞，對提高人口素質和全民族健康水平具有重要的現實意義。致病基因的攜帶者檢測與產前診斷無疑是減少發病及提高人口素質的一個有效手段，攜帶者及產前診斷的目的是區別攜帶者及正常女性，使后者可以正常婚育；對攜帶者的胎兒進行基因檢測，主動阻斷血友病A致病基因傳遞，避免新的HA患兒出生。九十年代初有學者應用Southern雜交技術檢測重型HA患者，發現約近一半的患者存在FVIII基因內含子22倒位(IVS22)。但Southern雜交技術存在著操作步驟復雜、周期長(約1周)、需要放射性同位素和污染環境等缺點。隨著分子生物學技術的發展，特別是PCR技術建立和完善，近幾年興起的簡便、靈敏而快速的PCR技術逐漸取代Southern雜交技術。劉敬忠等人應用長距離PCR(LD-PCR)技術進行了多家系患者和攜帶者的診斷和篩查，但未應用于產前診斷。外文文獻曾報道應用改良的LD-PCR方法檢測FVIII內含子22倒位，但僅在方法上進行了探討，未將其應用于攜帶者和產前診斷。上海第二醫科大學瑞金醫院王學鋒教授等應用PCR技術，利用羊水對5名HA攜帶者進行了產前診斷，其方法是在孕婦妊娠16-22周時，在B超指引下抽取羊水20ml，提取脫落細胞DNA進行產前診斷。但該方法存在著所需樣品量大、提取的脫落細胞DNA純度低、易受母親DNA污染等缺點，影響了產前診斷的可靠性。
技術實現思路
本專利技術要解決的問題是，針對上述方法所存在的不足，提供一種簡便、準確、切實可行而便于推廣的應用胎兒臍血阻斷血友病A致病基因傳遞的方法。利用本專利技術的方法可以有效確定胎兒是否為血友病患者，對HA胎兒實施終止妊娠，阻斷致病基因的傳遞，降低HA的發病率，提高出生人口素質。本專利技術的應用胎兒臍血阻斷血友病A(HA)致病基因傳遞的方法，由以下步驟組成(1)樣品制備選擇有血友病A(HA)家族史的女性于妊娠20周后，在超聲引導下經皮抽取胎兒臍帶靜脈血0.9ml或1.8ml，立即與0.1ml或0.2ml3.8％枸櫞酸鈉抗凝劑混勻，同時以相同方法和用量抽取攜帶者及其丈夫和正常人外周靜脈血作對照；(2)離心將上述樣品于4℃條件下，以2400～2500轉/分鐘離心20～25分鐘，取上層1/3～2/3血漿進行凝血因子VIII活性(FVIIIC)和血管性血友病因子(vWF)血清學的生化測定；取白細胞層提取DNA進行PCR聯合基因診斷；(3)篩選分型依據上述測定的血漿凝血因子VIII活性和血管性血友病因子濃度，確診血友病A患者及其攜帶者，并根據血漿FVIIIC濃度將血友病A患者分為重型HA，其FVIIIC＜1％；中型HA，其FVIIIC1％～5％；輕型HA，其FVIIIC5％～25％、亞臨床型HA，其FVIIIC25％～45％；(4)直接基因診斷應用長距離PCR(LD-PCR)技術對上述樣品提取的DNA進行產前基因診斷，根據電泳條帶的大小和分子量的大小綜合判定患者是否存在FVIII基因內含子22倒位；若只出現12Kb帶，判為野生型即非倒位；若只出現11Kb帶，判為倒位患者；若出現12Kb和11Kb兩條帶，判為倒位的攜帶者(見圖1)；(5)阻斷HA致病基因傳遞對于上述判為倒位的患者或判為倒位的攜帶者，應終止妊娠，切斷HA致病基因的傳遞；(6)間接基因診斷對上述非倒位的重型HA、中型HA和輕型HA家系，依次采用Bcl-IPCR/RFLP分析技術、基因內含子13(CA)n及內含子22(GT)n(AG)n二核苷酸重復序列多態性分析技術及與FVIII基因緊密連鎖的可變串聯重復序列多態性分析技術(St14/VNTR)進行間接基因診斷；(7)阻斷HA致病基因傳遞步驟(6)依次進行的各步基因診斷中，當樣品判為HA患者或攜帶者時，終止妊娠，切斷HA致病基因的傳遞；未作的診斷步驟停止。上述步驟(2)所述的凝血因子VIII活性測定采用Bigg’s一期法檢測。上述步驟(2)所述的血管性血友病因子測定采用ELISA法或免疫比濁法檢測。上述步驟(4)所述的應用長距離PCR技術中，設計合成的三對引物是P5′-GCC CTG CCT GTC CAT TAC ACT GAT GAC ATT ATG CTG AC-3′；Q5′-GGC CCT ACA ACC ATT CTG CCT TTC ACT TTC AGT GCA ATA-3′；B5′-CCC CAA ACT ATA ACC AGC ACC TTG AAC TTA CCC TCT-3′。上述步驟(6)所述的Bcl-I PCR/RFLP分析技術中，設計合成的Bcl-I RFLP引物是Pl5′-TTC ATT TCA GTG GAC ATG TG-3′，P25′-CCT ATG GGA TTT GAG ATG GT-3′。上述步驟(6)所述的基因內含子13(CA)n及內含子22(GT)n(AG)n二核苷酸重復序列多態性分析技術中，基因內含子13(CA)n二核苷酸重復序列多態性引物是P15′-TGC ATC ACT GTA CAT ATG TAT CTT-3′，P25′-CCA AAT TAC ATA TGA ATA AGC C-3′；內含子22(GT)n(AG)n二核苷酸重復序列多態性引物是P35′-TTC TAA GAA TGT AGT GTG TG-3′，P45′-TAA TGC CCA CAT TAT AGA-3′。上述步驟(6)所述的FVIII基因緊密連鎖的可變串聯重復序列多態性分析技術(St14/VNTR)中，設計合成的引物是P15′-GGC ATG TCA TCA CTT CTC TCA TGT T-3′，P25′-CAC CAC TGC CCT CAC GTC ACT T-3′。上述步驟(4)所述的長距離PCR技術中，PCR反應條件是94℃預變性1-2分鐘，進入下列循環；94℃-98℃變性10-12秒，65-68℃復性和延伸10-15分鐘，共30個循環，在后20個循環中，每一個循環在65-68℃的保溫時間延長20秒。上述步驟(6)所述的Bcl-I PCR/RFLP分析技術中，擴增條件是94℃預變性2-5分鐘，58-60℃，40-90秒，70-72℃，30-40秒，30周期循環后，72℃延伸5分鐘。上述步驟(6)所述的基因內含子13(CA)n及內含子22(GT)n(AG)n二核苷酸重復序列多態性分析技術中，擴增條件是94℃預變性3-10分鐘，94℃變性30秒，50℃復性30本文檔來自技高網...

【技術保護點】

【技術特征摘要】
【國外來華專利技術】

【專利技術屬性】
技術研發人員：丁培芳，王勤友，孫汶生，申法奎，王謝桐，張雪芹，滕彬，
申請(專利權)人：山東省血液中心，
類型：發明
國別省市：