固相支持物上的核酸等溫擴增制造技術

本發(fā)明專利技術揭示了一些通過固相支持物等溫擴增核酸的方法。這些方法對需要高通量的應用是有用的，特別是核酸的序列測定。（*該技術在2021年保護過期，可自由使用*）

【技術實現(xiàn)步驟摘要】

本專利技術涉及核酸擴增領域。更具體地說，本專利技術涉及一種基于使用固相表面等溫擴增核酸的方法及裝置和試劑盒，其用于需要高通量的應用中，特別是核酸的序列測定。
技術介紹
核酸測序分析已成為生物學、生物技術和醫(yī)藥學中許多(研究)活動的基礎。測定核酸序列的能力隨著開始檢測人或其它高等生物大基因組序列以及例如單個核苷酸多態(tài)性(SNPs)的測定和篩選以及基因表達的監(jiān)測而變得日益重要。核酸測序提供的遺傳信息有著廣泛應用，如藥靶的發(fā)現(xiàn)和確認、疾病的診斷、風險評價、以及生物體鑒定和特性分析。由于對涉及生物體、疾病或個體群的遺傳信息的可靠數(shù)據(jù)的需求快速增長，因此提高測序方法的流通量變得越來越重要。這些應用的基本目的是確定屬于細胞型、生物體或個體群的感興趣核酸中包含的四種堿基腺嘌呤(A)、胞嘧啶(C)、鳥嘌呤(G)和胸腺嘧啶(T)或尿嘧啶(U)的序列。大多數(shù)核酸測序方法(參見YanH等人的評論，Science 2000，289(5486)1890-2)可以直接(采用引物驅動的核苷酸延伸或雜交技術)或間接(通過電泳分析和/或裂解分析)確定核酸序列。然而，任何一種使用核酸序列分析的應用其科學和經濟價值很大程度上取決于該方法的實際通量。當評估測序方法的流通量時，獲得分離的核酸所必須的努力構成要考慮的一個主要問題，而所得到的核酸在數(shù)量和質量上都是獲得可靠結果所能接受的。含有待測序的核酸的原始樣本通常不能提供作這種分析的足夠材料，除非原材料的量相對高和/或加入大量的人為干預。這在以下一種情況尤為重要當測序方法需要數(shù)百納克分離的DNA序列時，法醫(yī)的或存檔的DNA標本，或者由特定細胞類型獲得的mRNA樣本必須要用納克或更少的總基因組DNA為原材料來進行。為了解決這一問題，采用的主要方案是通過只產生感興趣核酸片段的幾個拷貝來擴增DNA序列。一般來說，核酸的擴增需要重復一系列動作a)提供第一核酸(模板)，其含有感興趣的序列；b)提供第二核酸(引物)，至少在其3’端含有與第一核酸所含的序列互補并毗鄰于感興趣的序列3’端或在其內部的一個序列；c)提供使模板和引物可在至少這兩個核酸互補區(qū)內轉換為單鏈分子的條件；d)提供位于模板和引物內的互補序列之間可以進行雜交的條件；e)提供一核酸聚合酶，其能夠按照Watson和Crick堿基配對原則(A-T、或A-U和C-G)從雜交引物3’端開始合成模板區(qū)互補鏈；f)使所得的雙鏈核酸(一條鏈屬于原來的模板，另一條鏈含有融合于該核苷酸可延伸的該模板區(qū)互補的序列的引物)的分離，以致每條鏈都可成為另一次雜交和聚合的模板。通常，還在擴增反應中加入第二引物，使它與毗鄰或在感興趣序列內部的部分新合成的鏈雜交來引發(fā)聚合反應。如果使用的兩種引物各自對一條互補鏈具有特異性，則重復這些循環(huán)可以合成多個模板序列的雙鏈拷貝，所述模板位于用來與引物雜交的序列之間。另外，如果只提供一種引物，就會產生多個單鏈拷貝。關鍵一點是要連續(xù)恢復可使原始和新合成的鏈去雜交(dehybridization)以及它們與游離引物分子雜交以重新引發(fā)聚合反應并快速產生所需量的特異性核酸序列的條件。引物分子的濃度通常比模板分子高得多，故可支持擴增過程的指數(shù)動力學。通常，核酸分子單鏈和雙鏈形式之間的轉換通過升高或降低進行擴增過程的系統(tǒng)的溫度來實現(xiàn)。在這一范圍內，擴增所需的元件(模板、引物、核酸聚合酶、核苷酸、鹽)要經受外部裝置產生的一系列加熱和冷卻階段。這樣一種方法通常稱為熱循環(huán)，用于公知技術聚合酶鏈式反應(PCR，Taylor GR，“PCRa Practical approach”中的“Polymerase chain reactionbasicprinciples and automation”，Mcpherson MJ等人編輯，牛津大學出版社，1991)，聚合酶鏈式反應按準確次序和預定時間實施下列步驟a)變性(90℃-95℃ 30-60秒)。外部裝置(以熱的形式)提供所需要的能量，這一能量使核酸分子運動水平上升到足以打破穩(wěn)定雙鏈構型的非共價鍵相互作用。如果模板和引物已經以單鏈形式存在，在第一次循環(huán)中可省略這一步，但后面的全部循環(huán)絕對需要該步驟。b)雜交(35℃-80℃ 30-90秒)。一旦溫度下降，引物和模板分子所含的互補序列就可以進行雜交。此溫度必須小心控制，以避免只有有限同源性的分子雜交，每一次雜交都要計算這一溫度，因為它是進入引物和模板互補區(qū)的核酸序列長度和C/G含量的函數(shù)。c)延伸(60℃-85℃ 60-180秒)。實際產生新核酸分子只有這一步。進行延伸的溫度是所選聚合酶的函數(shù)，除了少數(shù)情況外，它與雜交溫度不同。常用的聚合酶一般一分鐘或數(shù)分鐘內就可以使新合成的鏈完成延伸，這取決于待擴增的核酸的長度。直到這樣的延伸鏈至少部分不再由于延伸從而導致雙鏈分子釋放出單鏈分子，才會發(fā)生新引發(fā)事件。為了有足夠的核酸量作進一步分析，通常會重復這些步驟15-40次，之后，PCR擴增由于聚合酶耗盡一般會達到一平臺。即使根據(jù)PCR的基本方案研究了許多不同的技術、策略和反應條件，但由于PCR有以下一系列具體的要求而使其使用受到嚴重限制a)一加熱和冷卻裝置；b)一聚合酶，即使在核酸變性所要求的高溫下進行多次循環(huán)后，它仍然要保留高進行性和準確性；c)擴增過程分成多次循環(huán)，使得聚合沒有連續(xù)性，而與熱循環(huán)過程同步進行。核酸聚合反應無法以連續(xù)的方式實現(xiàn)，因為它規(guī)則地被中斷來重建游離引物和模板分子之間雜交所需的條件，從而減慢了整個過程。現(xiàn)有技術公開了各種解決方案，克服了經典的PCR的這樣一些限制，特別是提供了一些可供選擇的方法，無需熱循環(huán)就可以在等溫條件下進行鏈的分離和雜交。鏈置換擴增(Strand Diplacement Amplification，SDA)是一種等溫核酸擴增和檢測方法，該方法利用聚合酶與內切核酸酶共軛，內切核酸酶只切割聚合的鏈，使聚合酶置換這條鏈而產生一條新的聚合鏈(EP 497272；walker GT，PCR methods Appl.1993，3(1)1-6)。這種技術基于重復單鏈的切割、延伸和置換步驟，已被廣泛采用(WO /96/23904；Westin L等人，Nat Biotechnol2000，18(2)199-204)，但這種方法的應用也有限制。內切核酸酶必須與聚合酶一起加入，所以整個過程可進行的許可溫度范圍就會限制在兩種酶都可保持活性的溫度。就內切核酸酶而言，這樣一個溫度范圍(通常為25℃-50℃)通常太低，以致無法避免引物與模板的非特異性雜交，導致大部分反應是非生產性的，或者產生不希望的產物。而且，作為引物和/或模板的核酸可能必須被再次修飾，因為強制要求待擴增的模板區(qū)必須不存在內切核酸酶解識別位點，而引物序列則必須始終有該識別位點。另一種技術是滾環(huán)擴增(Rolling Circle Amplification，RCA)，其利用DNA聚合酶在等溫條件下以線性或幾何動力學延伸循環(huán)寡核苷酸探針，作為鏈置換事件的復合型式的結果產生DNA分子的串聯(lián)連接拷貝來進行擴增(WalterNG和SttunkG，Proc Natl Acad Sci USA 1994，91(17)7937-41；WO 94/03624)。在此情況下，即使該技術已有不同的應本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術保護點】
一種等溫擴增至少一種含有高達１０００個核苷酸的核酸節(jié)段的方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟：ａ）形成至少一種含待擴增核酸的核酸模板，其中所述的核酸在５’端含有一寡核苷酸序列Ｙ，在３’端含有一寡核苷酸序列Ｚ，另外該核酸在５’端帶有 將所述的核酸固定于固相支持物的裝置；ｂ）形成一種或多種集落引物Ｘ，此集落引物Ｘ能與該寡核苷酸序列Ｚ雜交，其５’端帶有將所述集落引物固定于固相支持物的裝置；ｃ）將所述核酸模板和集落引物與溶液混合，此溶液在所述固相支持物存在下可 通過５’端將其固定于固相支持物上，以致核酸模板和集落引物的５’端與所述固相支持物結合；ｄ）將含有至少一種核酸聚合酶和核苷酸前體的擴增溶液加在所述的固相支持物，以便產生和等溫固定核酸，其序列與固定的核酸模板的序列相同或互補。

【技術特征摘要】
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【專利技術屬性】
技術研發(fā)人員：P邁耶，
申請(專利權)人：應用研究系統(tǒng)ARS股份公司，
類型：發(fā)明
國別省市：AN[菏屬安的列斯群島]