使用對照物測定核酸的方法技術

本發明專利技術涉及一種利用特異性對照核酸測定靶核酸的方法，一種利用引物和特異性對照物擴增所述靶核酸的部分序列的方法，一種含有所述對照物的試劑盒。這些對照核酸的序列至少部分平行互補于靶核酸的序列。這些對照物在雜交和擴增方法中具有與靶核酸類似的性質，但根據它們不同的序列可很清楚地與靶核酸區分開。（*該技術在2022年保護過期，可自由使用*）

【技術實現步驟摘要】
【國外來華專利技術】
本專利技術涉及一種使用特異性對照核酸進行靶核酸鑒定的方法，一種使用引物和特異性對照核酸擴增所述靶核酸部分序列的方法以及含有所述對照核酸的試劑盒。
技術介紹
核酸的鑒定在分析化學中已成為一種重要的工具，特別是在保健中。例如，在個體來源的樣品中存在一定數量指示疾病或體質的核酸的基礎上容易鑒定出感染的疾病和遺傳體質。為此，利用核酸，優選寡核苷酸，與指示那種疾病或遺傳體質的靶核酸序列特異性雜交建立了各種方法。靈敏的技術如分支DNA方法(美國專利Nos.5,681,702，5,597,909，5,545,730，5,594,117，5,591,584，5,571,670，5,580,731，5,571,670，5,591,584，5,624,802，5,635,352，5,594,118，5,359,100，5,124,246和5,681,697)，或檢測在生物體中高拷貝數存在的rRNA靶核酸的方法(Ep0272009)，都可以直接用來檢測那種生物體來源樣品中的靶核酸。但是有許多靶核酸在生物體中存在的量非常低，以至于不可能從該生物體得到的樣品中直接檢測。這樣的靶核酸需要在檢測前擴增。適用的擴增方法可以是例如LCR(美國專利Nos.5,185,243，5,679,524和5,573,907；EP 0 320 308 B1；WO90/01069；WO89/12696；和WO89/09835)，循環探針技術(美國專利Nos.5,011,769，5,403,711，5,660,988，和4,876,187，和PCT公開申請WO95/05480，WO95/1416，和WO95/00667)，侵入物TM技術(技術專利Nos.5,846,717；5,614,402；5,719,028；5,541,311；和5,843,669)，Q-Beta復制酶技術(美國專利No 4,786,600)，NASBA(美國專利No.5,409,818；EP～0 329 822)，TMA(美國專利Nos.5,399,491，5,888,779，5,705,365，5,710,029)，SDA(美國專利Nos.5,455,166和5,130,238)和PCR(US-A-4,683,202)。為將核酸檢測的錯誤結果降至最低，幾個國家的權威要求使用對照核酸。特別是使用擴增方法時，這種對照核酸是十分重要的，因為反應條件可強烈影響擴增過程，從而得到錯誤的結果。有時抑制物質也包含在樣品中，其可能導致錯誤的陰性結果。一般情況下，可以區別外部對照和內部對照。外部對照，如經典的陽性和陰性對照經常用于檢測試驗是正確進行還是摻入了污染物。內部對照舉例來說可以用于識別樣品中可能含有的抑制物質，或者能在定量測試中作為定量標準。與通常在獨立的反應室內測定的外部對照相反，內部對照優選與待分析物一起在同一個反應室內孵育。所以，對照或對照的擴增產物必須能夠與待分析物或待分析物的擴增產物區分開。當使用一種擴增方法時，內部對照核酸基本與靶核酸在相同反應條件下共擴增。這些條件包括試劑濃度，溫度，抑制劑濃度或酶活性。經常使用的對照序列來源于管家基因(見Chelly等(1990)歐洲生物化學雜志(Eur.J.Biochem)187；691-698；Mallet等.(1995)臨床微生物雜志(J.Clin.Microbiol)，333201-3208)，但是也使用非天然的序列(Resnard等(1995)臨床微生物雜志(J.Clin.Microbiol)32.1887-1893；Gilliland等(1990)美國國家科學院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci，USA)872725～2729；Wang等(1989)美國國家科學院院干Proc.Natl，Acad.Sci.USA)9717-9721)。內部對照來源的擴增核酸與靶核酸來源的擴增核酸能夠區別開，例如通過它們不同的長度或與特殊探針的雜交能力(見Clementi等(1990)PCT方法應用(PCRMethods Applic)2191-196；Clementi等(1995)病毒手冊(Arch.Virol.)1401523-1539)。在任何情況下，內部對照的核苷酸序列與靶核酸序列是部分或全部不同的。因為核酸的序列和長度決定它的GC含量，二級結構和熔解溫度，所以，對其在雜交反應和擴增反應中的表現很重要。幾乎在所有情況下，一個內部對照的不同序列導致該對照核酸與靶核酸具有不同的表現。與此相反，為正確監測反應，一個理想的內部對照應該精確地模仿靶核酸。擴增反應中一個最重要的方面是引物與靶核酸的結合。所以，使用與靶核酸具有相同引物結合位點的內部對照(例如見Gilliland等(1990)美國國家科學院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)87；2725-2729；Wang等(1989)美國國家科學院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)9717-9721；US5,219,727)。這樣可能引起與引物的競爭反應，并且可能降低實驗的靈敏度。Gilliland等人(1990)美國國家科學院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)87；2725-2729敘述了與靶核酸具有幾乎相同核苷酸序列的內部對照，但包含一個新的限制性酶切位點，或含有靶核酸不具備的內含子區序列。由于內部對照與靶核酸非常高的同源性，這兩種核酸及其擴增物可以互相雜交。根據所用檢測方法，可導致錯誤的結果，特別是在定量實驗中。而且，所述方法需要精細的技術，如對擴增產物進行限制性酶消化和瓊脂糖凝膠電泳。本專利技術的一個目的是提供一種改進的鑒定核酸的方法，尤其是避免已知方法中所有或部分的不足。專利技術概述本專利技術主要目的是提供與靶核酸的屬性相似的核酸，包括長度，G/C含量，二級結構和折疊動力學性質，以及更多方面，而該核酸能根據它們的序列與各自靶核酸輕易地區分開。為實現該目的，構建一個序列，其基本上包括所述待測靶核酸區域或所述靶核酸區的互補鏈，且其至少部分與靶核酸鏈平行互補或與其互補鏈互補。多數情況下，對照核酸序列的一個或幾個平行互補部分可從短鏈，例如至少8個核苷酸，優選至少10個核苷酸，延伸至待測靶核酸的全長。本專利技術中優選的平行互補部分包括探針結合位點序列。另一優選方面，尤其是待測靶核酸區被擴增用于鑒定時，本專利技術中對照核酸也可包括引物結合位點，該結合位點與靶核酸區各自的引物結合位點平行互補。這種對照核酸可用于例如雜交和擴增方法中作為內部對照，所以在化學分析和醫學診斷領域中很有用。本專利技術還涉及擴增樣品中靶核酸序列的方法，包括步驟擴增所述靶核酸區和已知量的對照核酸，所述對照核酸基本上包含所述待擴增靶核酸區或所述靶核酸區的互補序列，從而所述基本上包含所述待擴增靶核酸或所述靶核酸互補區的對照核酸序列包括至少一個連續的，至少8個核苷酸的，基本平行互補于所述靶核酸或所述靶核酸互補鏈的序列。涉及擴增方法，這種對照核酸具有額外的優點。如果這些核酸的引物結合位點與靶核酸的引物結合位點平行互補，那么這些對照與結合到靶核酸的引物特性相近，盡管引物結合位點的序列和對照核酸的引物區別于靶核酸的引物。避免了靶核酸與對照擴增引物的競爭，提高了實驗的靈敏度和線性范圍。所述的對照可本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種擴增樣品中靶核酸區的方法，包括以下步驟擴增已知量的對照核酸和所述靶核酸，基本包括所述待擴增靶核酸的區或所述靶核酸區的互補序列的所述對照核酸特征在于基本包含所述待擴增靶核酸區或所述靶核酸互補序列的對照核酸區含有至少一個連續的，至少 ８個核苷酸的，基本平行互補于所述靶核酸區或所述靶核酸序列區的互補鏈的序列。

【技術特征摘要】
【國外來華專利技術】...

【專利技術屬性】
技術研發人員：S耶格，
申請(專利權)人：霍夫曼拉羅奇有限公司，
類型：發明
國別省市：CH[瑞士]