厭氧菌的一種快速檢測方法技術

厭氧菌感染的一種快速診斷的方法，涉及一種厭氧菌感染的診斷方法。其具體步驟為：標本采集，標本的預處理，標本的固相微萃取（ＳＰＭＥ），氣相色譜分析，由檢測出的厭氧菌代謝產生的揮發性短鏈脂肪酸成分峰，診斷出厭氧菌的存在。采用本發明專利技術，標本采集無特殊要求，標本保送無特殊條件要求及時間限制，不需培養，可以快速檢測出患者是否有厭氧菌感染情況，診斷時間僅需３０～４０分鐘。本發明專利技術不受正常寄居菌的影響，檢測陽性率高，診斷可靠。不僅可用于厭氧菌感染的診斷，而且可用于病情監測，對厭氧菌感染性疾病的診治有很高價值。（*該技術在2022年保護過期，可自由使用*）

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及一種厭氧菌感染的診斷方法，具體地為用常規采樣，不經培養，可直接快速診斷的方法。
技術介紹
厭氧菌是一類只能在無氧或低氧分壓、低氧化還原電位(Eh)、含有一定CO2環境中才能生長的細菌，它只能從無氧酵解中獲得能量。厭氧菌的種類十分復雜，有30多個屬、數百種，隨厭氧培養、分離、鑒定技術的快速發展，還在不斷發現新種。臨床上感染致病常見的厭氧菌有10個屬30多種。厭氧菌作為正常菌群廣泛存在于人體皮膚深部和腔道深部黏膜表面。口、咽腔和腸道是人體內最大的厭氧菌的“儲菌庫”，是由于各種原因引起的菌群失調、機體免疫功能下降或細菌易位導致感染，它是一種十分常見的條件致病菌。臨床標本的厭氧菌分離率國外報告為51～78％，國內為30～67％。所以，不做厭氧菌診斷幾乎將遺漏掉50％以上的病原菌。很多厭氧菌對臨床常用抗菌藥物(如磺胺類、氨基糖甙類、大環內酯類、喹諾酮類和許多頭孢類藥物)不敏感。所以，不做厭氧菌診斷將導致病情延誤和藥物浪費。目前厭氧菌感染的診斷方法包括有以下幾種——1、細菌學診斷是一經典方法。它的診斷步驟應包括三級——(1)臨床標本原代厭氧培養+G+染色厭氧菌初步診斷；(2)分離厭氧培養+G+染色+某些生化實驗；(3)分離厭氧培養+特殊生化實驗和氣-液相色譜對其終末代謝產物進行分析。臨床檢測基本上停留于一級。為了保證診斷可靠性，下述每一個環節都應充分保障(1)標本的采集凡可能被正常菌群污染的標本，如咳痰、纖支鏡吸出的痰、一般纖支鏡細胞刷取的分泌物、支氣管-肺灌洗液、流出的膿、鼻-口-咽-肛-陰道-竇道拭子、中段尿或導尿、胃-腸內容物等，均無送檢價值，即90％以上的臨床常規采樣標本不能用來進行厭氧菌的細菌學診斷。以臨床最為常見的下呼吸道厭氧菌感染為例，要求標本采用肺穿刺、環甲膜穿刺、帶特殊保護套的纖支鏡細胞刷取的分泌物或氣管切開抽取物作標本，這不僅對患者帶來痛苦、風險，而且還需要一定的設施條件，故不可能廣泛普及開展。(2)標本保送標本采集后應盡量不接觸空氣。因在空氣中暴露可能引起兼性厭氧菌過度生長或標本干燥，而影響厭氧菌的生存，甚至造成死亡。通常采用方法為或注射器抽取后針頭橡皮封堵，在20～30min內送檢；或立即穿刺注入特制的密封的，預先充滿純N2的無氧密封小瓶中，組織標本置入特制的厭氧袋或罐在1～2h內送檢；或床邊立即接種。這不僅需要特殊裝置，而且稍有不慎即將會出現假陰性，臨床上難以達到要求。(3)厭氧培養采用低氧化還原電位培養基(要求新鮮配制)和嚴格無氧環境(70％N2+20％CO2+10％H2)。經常采用的是“厭氧罐”、“生物(厭氧袋)袋”、“厭氧室或厭氧手套箱”，即需要特殊的裝置。原代培養至少2～3天，排除診斷則需2周。診斷周期長，易貽誤病的治療。從上述可知，對于絕大多數厭氧菌感染的診斷無論從標本采樣、標本保送及厭氧培養都相當不易，所以，國內大多數醫院都沒有將其列為常規檢測。2、免疫學檢查熒光抗體染色法、酶聯免疫組化法等都已成功應用于厭氧菌感染的診斷，其與細菌學診斷符合率很高。但它們專屬性高，不同的厭氧菌要求不同的診斷盒，厭氧菌的科、屬、種如此之多，給配制帶來一定難度，故臨床實用價值不大。3、厭氧菌的分子生物學診斷DNA探針、基因擴增(PCR)技術也用于厭氧菌診斷研究。與免疫學檢測原因相同，其臨床實用價值不大。4、厭氧菌特殊代謝產物檢測厭氧菌代謝產生多種揮發或不揮發性短鏈脂肪酸，如乙酸、丙酸、丁酸、異丁酸、戊酸、異戊酸、己酸、乳酸、琥珀酸等。不同屬、種的厭氧菌產酸譜不同，以前主要用于厭氧菌屬、種鑒定。少數需氧菌也可產生乙酸、丙酸和乳酸，但不產生其他短鏈脂肪酸，特別是丁酸、異丁酸、戊酸、異戊酸、琥珀酸。上述短鏈脂肪酸可以直接或衍生化后進行氣相色譜(GC)分析診斷。采用氣相色譜分析方法對量大的標本(如胸-腹水、膽總管引流液等)直接采用有機溶劑(如乙醚、氯仿)反復萃取并濃縮后，或進一步衍生化處理(如甲酯化)后進行氣相色譜分析；對量小的標本(如支氣管-肺分泌物、抽取的少量膿液等)先行短程(1～3天)厭氧培養，然后將培養基采用有機溶劑反復萃取、濃縮并進一步衍生化處理(如甲酯化)后，再進行氣相色譜分析，若分析出有相當濃度的多種短鏈脂肪酸，特別是異丁酸、戊酸、異戊酸、琥珀酸，即可判斷其為厭氧菌感染。由于這方法(1)標本前采用處理采用有機溶劑反復萃取、濃縮并進行衍生化處理，故仍嫌煩瑣，而且因采用了大量有機溶劑萃取、濃縮會造成污染環境；(2)采用定量診斷標準，可是有機溶劑萃取、濃縮過程中短鏈脂肪酸亦將隨溶劑一起揮發，從定量的角度看，它的回收率不符合要求，重復性差；(3)臨床絕大多數標本是小量的，仍需預先厭氧培養。鑒于上述原因，其臨床應用價值不大，所以并未真正用于臨床。20世紀90年代發展起來的固相微萃取(SPME)技術遠比液相萃取法簡便、快捷、選擇性好、萃取效率高，并且無污染。SPME+色譜分析技術已廣泛應用于環境、食品、海關毒品和少數藥品的監測，迄今尚無臨床應用報告。
技術實現思路
本專利技術的目的是針對上述現狀，旨在提供一種對標本無任何要求，用常規采樣，不經培養，可通過厭氧菌代謝產生的多種特征性揮發性短鏈脂肪酸的存在，快速檢測出厭氧菌感染的快速診斷的方法。本專利技術的目的的實現方式為，，其具體步驟為1)標本采集用臨床普通常規方法采集標本2)標本的預處理(1)液體標本直接加飽和氯化鈉成飽和溶液后鹽析，(2)粘稠標本，如痰、膿類，加酸如2～10％鹽酸+次氯酸(1∶2～6)或酶震蕩消化數分鐘，充分溶解后，再加飽和氯化鈉鹽析，酶包括胰蛋白酶、糜蛋白酶、胃蛋白酶、菠蘿蛋白酶，(3)固體標本，如組織塊，先剪碎研磨成勻漿，再加酸或酶震蕩消化成溶液，后加飽和氯化鈉鹽析，酸與酶如上，3)標本的固相微萃取(SPME)萃取針頭采用有聚乙烯乙二醇/二乙烯苯、聚乙烯乙二醇/陰離子樹脂或聚二甲基硅氧烷/二乙烯苯復合涂層的針頭，萃取方式采用密封瓶離取樣液面1公分左右頂空萃取法，萃取1分鐘以上，或液中萃取5分鐘以上，6)氣相色譜分析色譜柱——彈性石英毛細管色譜柱或填充柱，固定相為聚乙二醇20M和2-硝基對苯二甲酸的反應物，簡稱FFAP，載氣——N2，檢測器——氫火焰檢測器或熱導池類檢測器，汽化室溫度——200～250℃，脫附時間——5～10以上秒，柱溫——90～150℃下恒溫，為理想分離各成分峰，或在60～220℃分二階或多階程序升溫，靈敏度——102～3，衰減1/1～8，7)診斷采用定性診斷，以明確、清晰檢出以下成分峰為陽性，即為厭氧菌感染 (1)明確、清晰檢出有異丁酸、戊酸、異戊酸峰中之一者，(2)明確、清晰檢出有乙酸、丙酸及另外一種短鏈脂肪酸峰中之一者，(3)明確、清晰檢出有二種非異丁酸、戊酸、異戊酸、乙酸、丙酸的短鏈脂肪峰者。本專利技術的萃取采用圖1中所示的固相萃取裝置，圖中1為萃取頭，2為手柄。采用頂空萃取時，為提高陽性率，宜在超聲震蕩、加溫或攪拌下進行。由于正常寄居與感染灶的厭氧菌密度及繁殖-代謝率有很大差異，口-咽腔-皮膚表面正常寄居的厭氧菌密度及繁殖-代謝率低，正常產生的短鏈脂肪酸量遠遠低于感染灶，本專利技術選擇國產氣相色譜儀SP-520型或其他型號的國產、進口氣相色譜儀，其靈敏度足以在測出臨床各種標本中的各種短鏈脂肪酸時不本文檔來自技高網...

【技術保護點】
厭氧菌感染的一種快速診斷的方法，其特征在于其具體步驟為：１）標本采集：用臨床普通常規方法采集標本２）標本的預處理：（１）液體標本直接加飽和氯化鈉成飽和溶液后鹽析，（２）粘稠標本，如痰、膿類，加酸如２～１０％鹽酸＋次氯酸（１∶２～６）或酶震蕩消化數分鐘，充分溶解后，再加飽和氯化鈉鹽析，酶包括胰蛋白酶、糜蛋白酶、胃蛋白酶、菠蘿蛋白酶，（３）固體標本，如組織塊，先剪碎研磨成勻漿，再加酸或酶震蕩消化成溶液，后加飽和氯化鈉鹽析，酸與酶如上，３）標本的固相微萃取（ＳＰＭＥ）：萃取針頭采用有聚乙烯乙二醇／二乙烯苯、聚乙烯乙二醇／陰離子樹脂或聚二甲基硅氧烷／二乙烯苯復合涂層的針頭，萃取方式采用密封瓶離取樣液面１公分左右頂空萃取法，萃取１分鐘以上，或液中萃取５分鐘以上，４）氣相色譜分析：色譜柱－彈性石英毛細管色譜柱或填充柱，固定相為聚乙二醇２０Ｍ和２－硝基對苯二甲酸的反應物，簡稱ＦＦＡＰ，載氣－Ｎ↓［２］，檢測器－氫火焰檢測器或熱導池類檢測器，汽化室溫度－２００～２５０℃，脫附時間－５～１０以上秒，柱溫－９０～１５０℃下恒溫，為理想分離各成分峰，或在６０～２２０℃分二階或多階程序升溫，靈敏度－１０↑［２～３］，衰減１／１～８，５）診斷：采用定性診斷，以明確、清晰檢出以下成分峰為陽性，即為厭氧菌感染（１）明確、清晰檢出有異丁酸、戊酸、異戊酸峰中之一者，（２）明確、清晰檢出有乙酸、丙酸及另外一種短鏈脂肪酸峰中之一者，（３）明確、清晰檢出有二種非異丁酸、戊酸、異戊酸、乙酸、丙酸的短鏈脂肪峰者。...

【技術特征摘要】

【專利技術屬性】
技術研發人員：薛存寬，王模榮，蔣鵬，王玲，袁彬，
申請(專利權)人：華中科技大學同濟醫學院附屬梨園醫院，
類型：發明
國別省市：83[中國|武漢]