檢測(cè)能污染某些食品的耐熱微生物的方法技術(shù)

一種能檢測(cè)雪白絲衣霉、Ｎｅｏｓａｒｔｏｒｙａ ｆｉｓｃｈｅｒｉ和Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒ－ｏｍｙｃｅｓ ｂａｉｌｉｉ的方法，它是利用包含在核糖體單位的內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ＩＴＳ）上的序列做為引物，通過(guò)目標(biāo)微生物基因組ＤＮＡ的擴(kuò)增進(jìn)行的： －對(duì)雪白絲衣霉， －在ＩＴＳ１上，對(duì)應(yīng)于ＳＥＱ ＩＤ１， －在ＩＴＳ２上，對(duì)應(yīng)于ＳＥＱ ＩＤ２， －對(duì)Ｎｅｏｓａｒｔｏｒｙａ ｆｉｓｃｈｅｒｉ， －在ＩＴＳ１上，對(duì)應(yīng)于ＳＥＱ ＩＤ３， －在ＩＴＳ２上，對(duì)應(yīng)于ＳＥＱ ＩＤ４， －對(duì)Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｂａｉｌｉｉ， －在ＩＴＳ１上，對(duì)應(yīng)于ＳＥＱ ＩＤ５， －在ＩＴＳ２上，對(duì)應(yīng)于ＳＥＱ ＩＤ６。（*該技術(shù)在2016年保護(hù)過(guò)期，可自由使用*）

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】

本專(zhuān)利技術(shù)涉及一種快速檢測(cè)耐熱真核微生物的方法，所述微生物能污染食品方面的某些產(chǎn)品，尤其是基于水果的產(chǎn)品。更具體地說(shuō)，所研究的微生物是兩種絲狀真菌即雪白絲衣霉(Byssochlamys nivea)和Neosartorya fischeri，以及一種酵母即Zygosaccharomyces bailii。食品的這些污染物能在基于水果的產(chǎn)品上出現(xiàn)，尤其是雪白絲衣霉能使食品產(chǎn)生令人不愉快的塑料或防腐劑型的特征；Neosartorya fischeri的生長(zhǎng)則是腐敗和產(chǎn)生真菌毒素的原因，而Zygosaccharomyces bailii則導(dǎo)致氣體的形成。這些微生物，尤其在孢子形態(tài)，表現(xiàn)出非常高的耐熱性，使得它們甚至可以耐受通常的應(yīng)用于食品工業(yè)的巴氏滅菌處理。可檢測(cè)這些微生物的現(xiàn)有試驗(yàn)包括，通過(guò)利用絲狀真菌的耐熱性，或酵母菌對(duì)某些通常用于這方面的防腐劑如苯甲酸的耐受性，作為一個(gè)選擇因素，來(lái)改變選擇性培養(yǎng)基的樣品。然而，這種形式的檢測(cè)包括培養(yǎng)，而且是相當(dāng)長(zhǎng)的培養(yǎng)，即從幾天到幾周，這使其在食品領(lǐng)域幾乎不能應(yīng)用，因?yàn)樗鼈兛赡馨óa(chǎn)品的很長(zhǎng)時(shí)間的保存，產(chǎn)品可能會(huì)被污染。所以，我們探索了一種檢測(cè)試驗(yàn)，它能快速地檢測(cè)這些微生物，所說(shuō)的試驗(yàn)?zāi)茉谧疃鄮仔r(shí)內(nèi)完成，以便迅速查出標(biāo)樣產(chǎn)品是否能繼續(xù)或在隨后的階段進(jìn)行處理。從而，本專(zhuān)利技術(shù)提出了一種可檢測(cè)雪白絲衣霉，Neosartorya fischeri和Zygosaccharomyces bailii的方法，該方法是利用包含在核糖體單位的內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS)上的序列對(duì)做為引物，通過(guò)目標(biāo)微生物基因組DNA的擴(kuò)增進(jìn)行的-對(duì)雪白絲衣霉，-在ITS1上，對(duì)應(yīng)于SEQ ID1，-在ITS2上，對(duì)應(yīng)于SEQ ID2，-對(duì)Neosartorya fischeri-在ITS1上，對(duì)應(yīng)于SEQ ID3，-在ITS2上，對(duì)應(yīng)于SEQ ID4，-對(duì)Zygosaccharomyces bailii-在ITS1上，對(duì)應(yīng)于SEQ ID5，-在ITS2上，對(duì)應(yīng)于SEQ ID6。在ITS1和ITS2序列中，將更具體地選擇，-對(duì)雪白絲衣霉，序列SEQ ID7和ID8，-對(duì)Neosartorya fischeri SEQ ID9和ID10，-對(duì)Zygosaccharomyces bailii SEQ ID11和ID12，在可使用的擴(kuò)增方法中，將更特別地使用所謂的PCR(聚合酶鏈反應(yīng))方法。實(shí)施例中詳細(xì)報(bào)道的試驗(yàn)表明，這些引物是完全識(shí)別性的，使區(qū)分預(yù)期微生物和那些甚至是很相近和相關(guān)的微生物成為可能。本專(zhuān)利技術(shù)還涉及一種檢測(cè)食品中的這些微生物的方法，尤其是基于水果的食品，而且更特別地是基于草莓的食品，在該方法中，將含有水果的樣品預(yù)處理，以便釋出并濃縮孢子或細(xì)胞，減輕或扼制Taq聚合酶抑制劑的作用，并且從孢子或細(xì)胞中提取DNA。更具體地說(shuō)，將含有固體產(chǎn)品的樣品用纖維素酶/半纖維素酶的混合物處理，以使它們液化，然后過(guò)濾，并在一定條件下離心，該條件下能獲得一種包含可從中提取DNA的細(xì)胞的產(chǎn)品。由于樣品最通常地含有Taq聚合酶抑制劑，必須提供一個(gè)步驟以便降低抑制劑的活性，或通過(guò)稀釋?zhuān)蛴帽椒?氯仿處理樣品并用醇沉淀來(lái)進(jìn)行。盡管本專(zhuān)利技術(shù)更特別地是針對(duì)食品工業(yè)，顯然它也能用于檢測(cè)可能與食品工業(yè)毫不相干的其它樣品中的微生物。最后，本專(zhuān)利技術(shù)涉及如上所定義的引物，以及使用所述引物的檢測(cè)試劑盒。本專(zhuān)利技術(shù)的其它特征和優(yōu)點(diǎn)將在閱讀下面的實(shí)施例時(shí)看到。實(shí)施例1-DNA的提取和擴(kuò)增方法(I)由大約5mm2的真菌菌絲，105個(gè)真菌孢子或106個(gè)酵母細(xì)胞開(kāi)始-在一個(gè)有螺旋蓋的微型管(1.5ml，Eppendorf型)中懸浮微生物于200μl的50mM Tris緩沖液中，緩沖液中含有20mM的EDTA，0.8％的SDS，pH8.5，向其中加入100μl的玻璃珠(直徑0.25-0.5mm)，-以最大頻率渦旋1分鐘，-混合物在100℃(沸水)保溫15分鐘，*對(duì)于孢子的處理，渦旋和保溫代之以-在液氮中冷凍，100℃沸騰5分鐘，-在液氮中再次冷凍，100℃沸騰10分鐘，-在10,000g離心1分鐘(臺(tái)式離心機(jī))，-回收上清液，-在水中10倍稀釋上清液。這種稀釋了的上清液直接用于擴(kuò)增。(II)擴(kuò)增是在最終體積25μl中進(jìn)行的，其中含20mMTris-HCl，pH8.5，16mM(NH4)2SO4，2.5mMMgCl2，150μg/ml的牛血清白蛋白，每一dNTP0.2μM和每一引物寡核苷酸100μM。反應(yīng)使用兩單位的Taq DNA聚合酶(BioTaq，Bioprobe，F(xiàn)rance)。擴(kuò)增反應(yīng)按如下方式在Perkin Elmer 2400熱循環(huán)儀(Perkin Elmer Corp.，USA)中進(jìn)行-對(duì)接合酵母屬(Zygosaccharomyces)，絲衣霉屬(Byssochlamys)和Neosartoria·在94℃15秒·在58℃10秒·在72℃20秒這一循環(huán)重復(fù)30次，接著在72℃末端延伸5分鐘。(III)所得產(chǎn)品在電泳凝膠中遷移后在紫外線(xiàn)下觀察，凝膠的組成如下1×TBE緩沖液，1μg/ml溴化乙錠，0.8％瓊脂糖。實(shí)施例2利用本專(zhuān)利技術(shù)的方法，觀察與被檢測(cè)的菌株相近的各種菌株，由所要求的幾組引物表現(xiàn)出極好的的識(shí)別力，結(jié)果給出如下。所使用的引物是-SEQ ID7和8是對(duì)雪白絲衣霉，-SEQ ID9和10是對(duì)Neosartorya fischeri，-SEQ ID11和12是對(duì)Zygosaccharomyces bailii。應(yīng)該注意的是煙曲霉(A.fumigatus)對(duì)探針有響應(yīng)，因?yàn)樗荖.fischeri的無(wú)性形式。對(duì)Neosartorya fischeri具有特異性的探針寡核苷酸屬種 菌株 T℃ hy. PCR反應(yīng)曲霉屬floriformisM 93 266357℃ 陰性曲霉屬煙曲霉 M 70 665 57℃ 陽(yáng)性曲霉屬煙曲霉 M 88 252157℃ 陽(yáng)性絲衣霉屬 雪白絲衣霉 M 90 149657℃ 陰性絲衣霉屬 雪白絲衣霉 M 93 293257℃ 陰性皮胞囊果屬nidulans M 88 251957℃ 陰性皮胞囊果屬nidulans M 84 255857℃ 陰性var.acristata皮胞囊果屬nidulans M 84 255657℃ 陰性var.dentata皮胞囊果屬nidulans M 68 198757℃ 陰性var.lata皮胞囊果屬nidulans M 84 955757℃ 陰性var.shinulata正青霉屬 brefeldianum M 89 257357℃ 陰性散囊菌屬 amstelodamiM 50 142 57℃ 陰性散囊菌屬 amstelodamiM 88 253657℃ 陰性散囊菌屬 repens M 66 253457℃ 陰性Mariannae elegansM 95 377757℃ 陰性紅曲屬紅色紅曲 M 65 107957℃ 陰性Neosartorya fennelliae M 93 298257℃ 陽(yáng)性Neosartorya fennelliae M 95 378l57℃ 陽(yáng)性NeosartoryafennelliaeM 95 378057本文檔來(lái)自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】

【技術(shù)特征摘要】

【專(zhuān)利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：E·E·T·克薩夫澤茲，R·奧夫里里，
申請(qǐng)(專(zhuān)利權(quán))人：U·N·I·R·公司，
類(lèi)型：發(fā)明
國(guó)別省市：