一種同時檢測原料乳中多種致病菌的方法及檢測試劑盒，它涉及了一種檢測原料乳中細(xì)菌的方法及檢測試劑盒。本發(fā)明專利技術(shù)解決了現(xiàn)有檢測原料乳中致病菌的方法中存在不能同時檢測多種致病菌、耗時長、費用高或不適用于檢測牛乳的問題。本發(fā)明專利技術(shù)同時檢測原料乳中多種致病菌的方法按照如下步驟進(jìn)行：一、將待檢測的原料乳去除脂肪；二、將步驟一保溫后的樣品過濾；三、收集洗脫液；四、進(jìn)行多重ＰＣＲ并對凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行分析；即得到檢測結(jié)果。本發(fā)明專利技術(shù)的試劑盒由Ｔａｑ酶溶液、多重ＰＣＲ反應(yīng)液、陰性對照液和陽性對照液組成。本發(fā)明專利技術(shù)的方法具有耗時短、費用低、適用于檢測牛乳和檢測結(jié)果準(zhǔn)確的優(yōu)點。本發(fā)明專利技術(shù)的試劑盒使用方便。
【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)涉及一種檢測原料乳中細(xì)菌的方法及檢測試劑盒。
技術(shù)介紹
牛乳作為一種廣泛食用并且是無數(shù)加工食品原輔料的重要動物源性食品 品種,是人類最理想的營養(yǎng)食品之一，人們對乳及乳制品的需求也在逐年增加。 然而牛乳也是一種最易遭受病菌污染而腐敗變質(zhì)的食品之一。乳制品中造成大 規(guī)摸人群食源性疾病暴發(fā)的主要致病菌包括金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、單增李斯特氏菌、沙門氏菌、布魯氏桿菌、志賀氏菌、蠟樣芽孢桿菌等。1994年 美國暴發(fā)了由沙門氏菌造成的冰淇淋污染，約有22400人患病。2000年日本 大阪市爆發(fā)了由金黃色葡萄球菌造成的乳制品中毒事件，發(fā)病者達(dá)10682人。 2001年在江蘇、安徽等地暴發(fā)的腸出血性大腸桿菌0157: H7食物中毒造成 177人死亡，中毒人數(shù)超過2萬人。此外，世界各地仍有因致病菌的存在而導(dǎo) 致乳制品中毒事件的頻頻發(fā)生。這些事件的發(fā)生無不說明了檢測乳中致病菌的 重要性。目前檢測乳中致病菌的方法除常規(guī)方法外主要應(yīng)用PCR技術(shù)，但應(yīng)用 PCR技術(shù)一次實驗只能檢測一種致病菌，而原料乳中可能同時存在多種不同 致病菌，有可能涉及不同種和型別的細(xì)菌，所以近些年來出現(xiàn)了一次實驗可以 檢測多種致病菌的多重PCR技術(shù)，但現(xiàn)在還沒有針對乳中多種主要的致病菌 進(jìn)行一次性的多重PCR檢測。此外直接應(yīng)用多重PCR技術(shù)需要8~12h的預(yù)增 菌時間，耗時長；通過加入過濾技術(shù)來快速富集菌體以節(jié)省預(yù)增菌的時間，如 美國的杜邦公司開發(fā)出了 BAX檢測系統(tǒng)，這些系統(tǒng)可以在很短的時間內(nèi)檢出 致病菌，但這些體系所需的儀器動輒數(shù)十萬元，目前還不能普遍應(yīng)用，并且現(xiàn) 有采用過濾技術(shù)富集菌體只能過濾畜禽類肉品清洗后的污水等較"澄清，，的樣 品，對于牛乳這種相對"混濁"且成分復(fù)雜的樣品，雖有人也采用過濾技術(shù)進(jìn)行 過濾，但一次過濾只能富集到一種致病菌。
技術(shù)實現(xiàn)思路
本專利技術(shù)是為了解決現(xiàn)有檢測原料乳中致病菌的方法中存在不能同時檢測 多種致病菌、耗時長、費用高或不適用于檢測牛乳的問題，而提供一種同時檢 測原料乳中多種致病菌的方法及檢測試劑盒。本專利技術(shù)同時檢測原料乳中多種致病菌的方法按照如下步驟進(jìn)行 一、將200mL待檢測的原料乳以3000g的離心力離心15min，去除上層的脂肪，得到 不含脂肪的樣品，向樣品中加入30mL、體積濃度為50n/。的EDTA-2Na溶液， 在37"C的水浴中保溫30min; 二、將步驟一保溫后的樣品通過蔡氏過濾器進(jìn)行 過濾，過濾后的濾膜剪成碎片，放入干燥無菌的燒瓶，向燒瓶中加入20mL的 生理鹽水，放在漩渦振蕩器上震蕩洗脫2min;三、收集洗脫液，以10000g 的離心力離心5min，取下層菌體沉淀用lmL的滅菌雙蒸水溶液重新懸浮，再 以10000g的離心力離心5min，棄去上清液，即得到菌體；四、利用細(xì)菌基因 組試劑盒提取細(xì)菌基因組DNA作為多重PCR模板，最后進(jìn)行多重PCR，然 后以2y。凝膠電泳鑒定PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，并以凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行分析；即得到檢 測結(jié)果；步驟四50nL多重PCR反應(yīng)體系由44^iL的多重PCR反應(yīng)液、2pL濃 度為2.5U/pL的Taq酶溶液和4pL的DNA模板組成；其中44^iL的多重PCR 反應(yīng)液由5pL的10 xpCR buffer、 3^iL濃度為10_2mol/L的dNTPs、 8pL的引 物液和28pL的滅菌雙蒸水組成，引物液中含有單增李斯特氏菌引物 2.5xlO—Umo1、沙門氏菌引物1.25xl(r1111101、金黃色葡萄球菌引物2.5xl0-umol、 大腸桿菌0157:H7引物1.25xl()-Umo1和蠟樣芽孢桿菌引物2.5 xlO^mol;擴(kuò) 增反應(yīng)條件為預(yù)變性95-C5min，變性94。C50s，退火59。C50s，延伸72。C50s， 共40個循環(huán)，延伸7(TCl0min;單增李斯特菌上游引物為5，-CACTGCATCTCCGTGGTATACTAA-3,，單增李斯特菌下游引物為5，-TGCAAGTCCTAAGACGCCA-3，， 沙門氏菌上游引物為 5，-ACTCTGCCGGGATTCCCACT-3，， 沙門氏菌下游引物為 5，-CAGTCCTAACGACGACCCTTCT-3，，金黃色葡萄球菌上游引物為5，-AAGGGCAATACGCAAAGAGGT-3，，金黃色葡萄球菌下游引物為5，-AATGCACTTGCTTCAGGACCATA-3，，大腸桿菌0157:H7上游引物為5，國 AACAGGAGGTGTCAGTAGGGAAGC-3'，大腸桿菌0157:H7下游引物為5，-CCCCATCATCGCCGTATAGTC-3，，蠟樣芽孢桿菌上游引物為5，-TGGACAAACTCAAACTCAAACGAC-3，，蠟樣芽孢桿菌下游引物為5，-TGTTACTCCACCGATTACAGCGT-3 ，。本專利技術(shù)的單增李斯特菌引物為根據(jù)單增李斯特菌設(shè)計的李氏溶血素O基因(/2(^)特異性引物，沙門氏菌引物為根據(jù)沙門氏菌設(shè)計的吸附和侵襲上皮細(xì)胞表面蛋白基因(/m^4)特異性引物，金黃色葡萄球菌引物為根據(jù)金黃色 葡萄球菌設(shè)計耐熱性核酸酶基因(m/c)特異性引物，大腸桿菌0157:H7引物 為根據(jù)大腸桿菌0157:H7腸溶血素A基因(W>^)特異性引物，蠟樣芽孢桿 菌引物為根據(jù)蠟樣芽孢桿菌腸毒素FM基因(e"WM)特異性引物。本專利技術(shù)同時檢測多種致病菌的試劑盒中按照體積份數(shù)由1份、濃度為 2.5U/jiL的Taq酶溶液、20份的多重PCR反應(yīng)液、1份的陰性對照液和1份 的陽性對照液組成；其中每44pL的多重PCR反應(yīng)液由5pL的10 xPCRbuffer、 3pL濃度為l(T2mol/L的dNTPs、 8pL的引物液和28pL的滅菌雙蒸水組成， 引物液中含有單增李斯特氏菌引物2.5xlO—Umo1、沙門氏菌引物1.25xlO—Umo1、 金黃色葡萄球菌引物2.5xl(T1111101、大腸桿菌0157:H7引物1.25xl(T1111101和蠟 樣芽孢桿菌引物2.5 xl0—Umol;陽性對照液為五種致病菌標(biāo)準(zhǔn)菌株培養(yǎng)液中提 取的基因組DNA;陰性對照液為滅菌雙蒸水。本專利技術(shù)的試劑盒用于檢測原料乳中的單增李斯特菌、沙門氏菌、金黃色葡 萄球菌、大腸桿菌0157:H7和蠟樣芽孢桿菌。本專利技術(shù)同時檢測原料乳中多種致病菌的方法具有以下優(yōu)點1、單次檢測 時間比直接應(yīng)用多重PCR技術(shù)檢測時間節(jié)省了 7 11個小時，操作簡單、快速； 2、能夠同時檢測原料乳中五種主要致病菌；3、具有很高的特異性，并且檢測 靈敏度最低達(dá)到1(^cfU/mL;4、采用離心脫脂后再用EDTA處理乳中的蛋白質(zhì)， 快速過濾技術(shù)能夠應(yīng)用于富集牛乳中的菌體，節(jié)省了菌體富集時間；5、不需 要昂貴的測試儀器；6、用于檢測致病菌的引物根據(jù)致病菌基因設(shè)計，特異性 強(qiáng)、針對性好。本專利技術(shù)同時檢測原料乳中多種致病菌的試劑盒具有以下優(yōu)點1、比現(xiàn)有 的多重PCR操作節(jié)約了步驟和時間；2、只需按照PCR操作的規(guī)程進(jìn)行操作， 操作人員不需要特別培訓(xùn)；3、提供陰性和陽性對照，以供實驗人員對結(jié)果進(jìn) 行準(zhǔn)確分析；4、能夠同時檢測原料乳中五種主要致病菌。附圖說明圖1為具體實施方式一檢測牛乳的電泳結(jié)果圖；其中1泳道為標(biāo)準(zhǔn)Marker; 2泳道為污染梯度為1本文檔來自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護(hù)點】
一種同時檢測原料乳中多種致病菌的方法，其特征在于同時檢測原料乳中多種致病菌的方法按照如下步驟進(jìn)行：一、將２００ｍＬ待檢測的原料乳以３０００ｇ的離心力離心１５ｍｉｎ，去除上層的脂肪，得到不含脂肪的樣品，向樣品中加入３０ｍＬ、體積濃度為５０％的ＥＤＴＡ－２Ｎａ溶液，在３７℃的水浴中保溫３０ｍｉｎ；二、將步驟一保溫后的樣品通過蔡氏過濾器進(jìn)行過濾，過濾后的濾膜剪成碎片，放入干燥無菌的燒瓶，向燒瓶中加入２０ｍＬ的生理鹽水，放在漩渦振蕩器上震蕩洗脫２ｍｉｎ；三、收集洗脫液，以１００００ｇ的離心力離心５ｍｉｎ，取下層菌體沉淀用１ｍＬ的滅菌雙蒸水溶液重新懸浮，再以１００００ｇ的離心力離心５ｍｉｎ，棄去上清液，即得到菌體；四、利用細(xì)菌基因組試劑盒提取細(xì)菌基因組ＤＮＡ作為多重ＰＣＲ模板，最后進(jìn)行多重ＰＣＲ，然后以２％凝膠電泳鑒定ＰＣＲ擴(kuò)增產(chǎn)物，并以凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行分析；即得到檢測結(jié)果；步驟四５０μＬ多重ＰＣＲ反應(yīng)體系由４４μＬ的多重ＰＣＲ反應(yīng)液、２μＬ濃度為２．５Ｕ／μＬ的Ｔａｑ酶溶液和４μＬ的ＤＮＡ模板組成；其中４４μＬ的多重ＰＣＲ反應(yīng)液由５μＬ的１０×ＰＣＲ ｂｕｆｆｅｒ、３μＬ濃度為１０↑［－２］ｍｏｌ／Ｌ的ｄＮＴＰｓ、８μＬ的引物液和２８μＬ的滅菌雙蒸水組成，引物液中含有單增李斯特氏菌引物２．５×１０↑［－１１］ｍｏｌ、沙門氏菌引物１．２５×１０↑［－１１］ｍｏｌ、金黃色葡萄球菌引物２．５×１０↑［－１１］ｍｏｌ、大腸桿菌Ｏ１５７：Ｈ７引物１．２５×１０↑［－１１］ｍｏｌ和蠟樣芽孢桿菌引物２．５×１０↑［－１１］ｍｏｌ；擴(kuò)增反應(yīng)條件為預(yù)變性９５℃５ｍｉｎ，變性９４℃５０ｓ，退火５９℃５０ｓ，延伸７２℃５０ｓ，共４０個循環(huán)，延伸７０℃１０ｍｉｎ；單增李斯特菌上游引物為５’－ＣＡＣＴＧＣＡＴＣＴＣＣＧＴＧＧＴＡＴＡＣＴＡＡ－３’，單增李斯特菌下游引物為５’－ＴＧＣＡＡＧＴＣＣＴＡＡＧＡＣＧＣＣＡ－３’，沙門氏菌上游引物為５’－ＡＣＴＣＴＧＣＣＧＧＧＡＴＴＣＣＣＡＣＴ－３’，沙門氏菌下游引物為５’－ＣＡＧＴＣＣＴＡＡＣＧＡＣＧＡＣＣＣＴＴＣＴ－３’，金黃色葡萄球菌上游引物為５’－ＡＡＧＧＧＣＡＡＴＡＣＧＣＡＡＡＧＡＧＧＴ－３’，金黃色葡萄球菌下游引物為５’－ＡＡＴＧＣＡＣＴＴＧＣＴＴＣＡＧＧＡＣＣＡＴＡ－３’，大腸桿菌Ｏ１５７∶Ｈ７上游引物為５’－ＡＡＣＡＧＧＡＧＧＴＧＴＣＡＧＴＡＧＧＧＡＡＧＣ－３’，大腸桿菌Ｏ１５７∶Ｈ７下游...
【技術(shù)特征摘要】
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：姜毓君，呂琦，趙鳳，劉偉，韓希妍，畢宇涵，王明娜，張光輝，相麗，閆冰，
申請(專利權(quán))人：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)，
類型：發(fā)明
國別省市：93[中國|哈爾濱]
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