表達(dá)嗜熱子囊菌光孢變種基因Mn-sod的畢赤酵母工程菌株制造技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)是一種表達(dá)嗜熱子囊菌光孢變種（Ｔｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ　ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ　ｖａｒ．ｌｅｖｉｓｐｏｒｕｓ）熱穩(wěn)定錳超氧化物歧化酶（Ｍｎ－ＳＯＤ）基因Ｍｎ－ｓｏｄ的畢赤酵母工程菌株Ｐｉｃｈｉａ　ｐａｓｔｏｒｉｓ　ＭＳ１８。通過ＲＴ－ＰＣＲ方法從嗜熱子囊菌光孢變種獲得錳超氧化物歧化酶基因Ｍｎ－ｓｏｄ，將其克隆并插入到畢赤酵母整合表達(dá)載體ｐＰＩＣ９Ｋ中，然后將得到的錳超氧化物歧化酶基因Ｍｎ－ｓｏｄ表達(dá)載體ｐＰＩＣ９Ｋ／Ｍｎ－ｓｏｄ導(dǎo)入到畢赤酵母ＧＳ１１５中，再從中篩選出一種表達(dá)錳超氧化物歧化酶的酵母工程菌ＭＳ１８。該工程菌經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)６ｄ后，酶表達(dá)量為０．９２ｍｇ／ｍＬ，酶活為２３２４Ｕ／ｍＬ，分子量為８６．０ｋＤａ，酶在５０、６０℃下活性穩(wěn)定，８０℃保溫４０ｍｉｎ后酶活仍剩余５０％，在９０℃處理６０ｍｉｎ仍具有２０％的活性，具熱穩(wěn)定性，可用于熱穩(wěn)定錳超氧化物歧化酶的生產(chǎn)菌株，有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和社會(huì)價(jià)值。

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】

本專利技術(shù)涉及生物工程，具體地說是一種表達(dá)嗜熱子囊菌光孢變種 (r力ei7z oa5"cwi1 ai/ra/2〃acws var. 7eF/，rws)熱穩(wěn)定錳超氧化物歧化酶 (Mn-S0D)基因Mn-sod的畢赤酵母工程菌株戶/c力/a /7aWar2、 MS18。
技術(shù)介紹
超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase,簡稱SOD) (EC, 1. 15. 1. 1)系一類金屬酶，廣泛存在于生物體中。它能夠催化超氧陰離子發(fā)生歧化反應(yīng)，從 而清除超氧陰離子。在生物體防御氧化損傷的過程中，發(fā)揮著重要作用。目前 SOD主要用于炎癥、腫瘤輻照病人、自身免疫系統(tǒng)疾病、某些心血管疾病等方面 的治療。據(jù)報(bào)道S0D在防衰老、防細(xì)胞損傷以及防止癌發(fā)生方面也起到了重要 的作用。在治療腎細(xì)胞癌方面，Mn-S0D可以有效的降低癌瘤帶來的損害，在治 愈胰腺癌方面，Mn-SOD的超表達(dá)可以抑制胰腺癌的發(fā)展。Mn-SOD在抑制視網(wǎng)膜 病及糖尿病心肌病致病機(jī)理方面發(fā)揮著重要作用。嗜熱子囊菌光孢變種(7力er/wc^CiAy awra/2"'ac"s var. /eWsporws)是一 種分布廣泛、生長上限溫度較高的真菌。它能夠產(chǎn)生熱穩(wěn)定的具有重要價(jià)值的 S0D酶，但是野生菌用于大規(guī)模的工業(yè)生產(chǎn)SOD酶，還存在一些尚未解決的問 題。如嗜熱菌培養(yǎng)條件比較苛刻，嗜熱酶的大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)需要特殊設(shè)備，而 且產(chǎn)酶效率低，從而造成產(chǎn)品成本增加，因此限制了它的應(yīng)用。解決這一問題 的有效途徑是應(yīng)用分子生物學(xué)手段，將熱穩(wěn)定S0D酶基因?qū)胫袦匦臀⑸锝?母中高效表達(dá)，利用酵母生長快、易于培養(yǎng)等特點(diǎn)，使SOD酶基因在常溫和短 時(shí)間內(nèi)快速、大量表達(dá)，期望達(dá)到降低能耗和提高經(jīng)濟(jì)效益的目的。 (三)
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
本專利技術(shù)從嗜熱子囊菌光孢變種(r力ei7ira"cwi" awra/ 〃aciAy var. 7eK/^Oi7Ay)獲得S0D酶基因的全長cDNA ，命名為Mn-sod (EF428323 ),并將 Mn-sod構(gòu)建到表達(dá)載體pPIC9K上，轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115菌株，獲得畢赤酵母工 程菌株MS18。利用獲得的嗜熱子囊菌光孢變種Mn-sod基因，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒載體 pPIC9K/Mn-sod，利用電轉(zhuǎn)儀提供的優(yōu)化參數(shù)進(jìn)行電擊轉(zhuǎn)化戶/c力/a /^"or" GS115,在MD和固培養(yǎng)基上篩選，經(jīng)PCR鑒定篩選陽性轉(zhuǎn)化子，G418篩選多拷貝 轉(zhuǎn)化子，然后進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。獲得一重組子MS18。該工程菌株接種于含BMGY培 養(yǎng)基中，在30。C 250 rpm/min搖床培養(yǎng)7d后，酶表達(dá)量為O. 92 mg/mL,酶活為 2324U/mL,分子量為86.0kDa，酶在50， 6(TC下活性穩(wěn)定，8(TC保溫40min后酶 活仍剩余50%,在9(TC處理60min仍具有2(T/。的活性。該工程菌株MS18能夠高效表達(dá)(O. 92 mg/mL， 2324U/mL)嗜熱子囊菌光孢 變種Mn-S0D酶基因Mn-sod,分泌的Mn-SOD酶具高的熱穩(wěn)定性，用于熱穩(wěn)定 Mn-S0D酶的生產(chǎn)菌株，有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和社會(huì)價(jià)值。(四) 附圖說明圖1表達(dá)嗜熱子囊菌光孢變種基因Mn-sod的畢赤酵母工程菌株程序圖 0是嗜熱子囊菌光孢變種的分離鑒定 0是嗜熱子囊菌光孢變種Mn-S0D酶基因Mn-sod的克隆 g是基因Mn-sod表達(dá)載體的構(gòu)建 0是表達(dá)基因Mn-sod的酵母工程菌株的構(gòu)建及篩選 0是畢赤酵母尸/c力/a GS115的誘導(dǎo)表達(dá)和活性檢測0是表達(dá)嗜熱子囊菌光孢變種基因Mn-sod畢赤酵母工程菌株MS18的保藏圖2 Mn-sod基因PCR產(chǎn)物電泳圖譜泳道1: Marker-DL2000 泳道2:全長cDM (分子量878 bp) 圖3 Mn-S0D酶的SDS-PAGE分析a) 泳道M:低分子量蛋白標(biāo)準(zhǔn) 泳道l:對(duì)照泳道2-7:酵母工程菌尸/c力/a MS18的誘導(dǎo)2-7天b) 泳道M:低分子量蛋白標(biāo)準(zhǔn)泳道l:純化的重組Mn-SOD酶(分子量21.7 kDa ) 具體實(shí)施例方式1、 嗜熱子囊菌光孢變種(r力e/7Z7c^sc^ awra/ 〃acws var. /e"^ my)的分離鑒定(l)標(biāo)本釆集從堆肥中釆集，地點(diǎn)北京。(2 )分離培養(yǎng)將釆集標(biāo)本取0. 5克放置在PDA平板上5(TC培養(yǎng)3天后， 進(jìn)行分離純化。搡作步驟參考Cooney and Emerson (1964)文獻(xiàn)。 (3)鑒定參考Cooney and Emerson (1964)文獻(xiàn)。2、 嗜熱子囊菌光孢變種(7Xe/7z/o3SCi/s ai/ra/2〃aci/s var. /e"5^ms)Mn-S0D 酶基因Mn-sod的克隆 '(1) 嗜熱子囊菌光孢變種總RNA的提取參照Trizol試劑盒說明。(2) cDM第一條鏈的合成按照Promega公司的Reverse Transcription Reaction試劑盒說明書進(jìn)行，以01 igo ( dT ) 20為引物合成cDM第一鏈。反 應(yīng)條件為42'C1小時(shí)；85t:i0分鐘。(3) PCR反應(yīng):上游引物5， - ATGGCCGCTTCCCTCGTT -3，， 下游引物5， - TTAAGCGGCGAAGCGCTT -3'。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR )試劑與條件為10 X反應(yīng)緩沖液2. 5 jal 25 mM MgCl2 2 jLi 110 mM dNTP2 pi上游引物(10 |iM) 1下游引物(10 iaM) 1 )il模板cDM2 piTaq DNA聚合酶0.5 pi滅菌雙蒸水14 jul總體積25 julPCR反應(yīng)條件為:95'C預(yù)變性4 min; 94。C變性lmin; 59。C退火1 min, 72°C 延伸1 min, 30個(gè)循環(huán)；72。C再延伸10 min。 (4)基因克隆取2nl PCR產(chǎn)物與pGEM-T easy載體進(jìn)行連接，操作步驟 按照Promega公司產(chǎn)品說明書進(jìn)行。然后連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 oc菌株，在 表面涂5-溴-4-氯-3-吲哚-P-D-半乳糖苷和X-gal的含氨卞青霉素(100jug/mL) 的LB平板上生長過夜。挑取白色菌落，在LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜。 (5 )質(zhì)粒DNA的提取堿法提取質(zhì)粒DNA。(6)序列測定DNA雙脫氧法測定核苷酸序列，序列測定由上海生物工程有 限公司完成，序列引物為M13啟動(dòng)子引物。嗜熱子囊菌光孢變種Mn-sod全長的 cDNA序列為878 bp,它的最大開放閱讀框ORF有696 bp，編碼231個(gè)氨基酸。 3、基因Mn-sod表達(dá)載體的構(gòu)建(1) 根據(jù)分離出的Mn-sod基因的核苷酸序列設(shè)計(jì)表達(dá)引物，在引物的5， 端分別引入&oA I和^M酶切位點(diǎn)上游引物5， - CCGAATTCAAGGCGACTCTCCCTGAC —3， Cfi"coA I) 下游引物5， - GGGCGGCCGCTTAAGCGGCGAAGCGCTT -3， )(2) 嗜熱子囊菌光孢變種總RNA的提取:利用Trizol試劑提取。(3) 反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一條鏈取2)ig總RNA，加入5 x反應(yīng)緩沖液4 ju L, lOraM dNTP 2 ju L，核糖核酸酶抑制劑(40本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一種表達(dá)嗜熱子囊菌光孢變種（Ｔｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ　ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ　ｖａｒ．ｌｅｖｉｓｐｏｒｕｓ）熱穩(wěn)定錳超氧化物歧化酶（Ｍｎ－ＳＯＤ）基因Ｍｎ－ｓｏｄ的畢赤酵母工程菌株Ｐｉｃｈｉａ　ｐａｓｔｏｒｉｓ　ＭＳ１８，其特征在于，通過ＲＴ－ＰＣＲ方法從嗜熱子囊菌光孢變種獲得熱穩(wěn)定錳超氧化物歧化酶基因Ｍｎ－ｓｏｄ，將該基因克隆到畢赤酵母分泌型表達(dá)載體ｐＰＩＣ９Ｋ，獲得表達(dá)重組質(zhì)粒ｐＰＩＣ９Ｋ／Ｍｎ－ｓｏｄ，轉(zhuǎn)化畢赤酵母ＧＳ１１５，從中篩選出表達(dá)嗜熱子囊菌光孢變種熱穩(wěn)定錳超氧化物歧化酶基因Ｍｎ－ｓｏｄ的畢赤酵母工程菌株ＭＳ１８，該菌株可作為熱穩(wěn)定錳超氧化物歧化酶的生產(chǎn)菌株。

【技術(shù)特征摘要】

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：李多川，宋寧寧，李安娜，李華，趙春青，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)，
類型：發(fā)明
國別省市：37[]