一株丙酮丁醇梭菌及其篩選方法和用途技術

本發明專利技術涉及生物發酵技術領域，具體涉及一株能快速利用淀粉發酵生產生物丁醇的丙酮丁醇梭菌及其篩選方法和用途。本發明專利技術公開了一種丙酮丁醇梭菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）菌株ＲＡＢ３２２６，屬于丙酮丁醇梭菌ＣＩＣＣ８０１１的突變株，保藏號為ＣＴＣＣ　Ｍ２０７１９９。本發明專利技術通過ＮＴＧ誘變，淀粉透明圈和丁醇結構類似物雙平板篩選，得到的菌株能夠快速利用淀粉發酵生產生物丁醇，丁醇比高，解決了傳統工藝上以玉米粉為原料廢醪ＣＯＤ高的問題，對環境更友好。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及生物發酵
，具體涉及一株通過誘變選育得到的丙酮 丁醇梭菌，以及該丙酮丁醇梭菌的篩選方法和該丙酮丁醇梭菌在快速利用淀 粉發酵生產生物丁醇中的應用。
技術介紹
丁醇是重要的化工材料單體。丁醇廣泛用于各種塑料和橡膠制品的生產。我國丁醇供需矛盾十分突出，進口量占消費量的50%以上。丁醇作為替代汽 油的生物燃料也得到國際上很大的重視。與乙醇相比，丁醇能與汽油以更高 的比例混和，更適合在現有的燃料供應和分銷系統中使用；生物丁醇的經濟 性更高，能提高車輛的燃油效率和行駛里程。與石油燃料相比，生物丁醇產 生是以可再生資源為原料，而且具有顯著的環境效益。丁醇的生產方法有生物法和化學法。化學法生產丁醇的原材料為石化下 游產品丙烯，預計到2010年，中國對丙烯的當量需求將達到1905萬噸，供 需缺口將達到825萬噸。而石油的價格飛漲和資源加速枯竭正在將已經成為 世界上第二大石油進口國的中國推向石油經濟時代的懸崖邊！開發發酵法生 產丁醇新技術除其直接經濟效益外還可以為開發新的可再生資源提供一條新 途徑。近年來，國內對丙酮丁醇發酵的研究很多，主要圍繞著菌種誘變、發酵 工藝條件優化、溶劑提取等方面進行研究。1995年顏敘秀報道利用紫外誘變 丙酮丁醇梭菌提高代謝產物；1999年馬光庭等進行了對糖蜜發酵生產丙酮丁 醇菌種篩選及對小試發酵條件的選擇進行了研究；ZL專利號95111733.5報 道了焦瑞身等對高丁醇比丙酮丁醇梭菌進行選育，他們通過化學試劑誘變， 利用玉米粉或者高粱，得到總溶劑在20g/L左右，丁醇產量為總溶劑的70%; 2001年，縣永平對丙酮丁醇梭菌固定化技術進行了研究；1998年，陳守 文等研究了稻草酶法水解液的丙酮丁醇發酵，研究將纖維資源用于丙酮丁醇 發酵。國外近年來主要圍繞著利用基因工程和采用新發酵工藝來提高菌株的 代謝性能和生產效率；比較有代表性的是美國Illinois大學所做的工作。他 們用膜滲透汽化與發酵耦聯進行ABE發酵的研究、利用gas-stripping和發 酵耦聯工藝進行ABE發酵的研究。2005年，美國專利US2005/0089979A1報 道了利用gas-stripping和連續發酵耦聯來生產丙酮丁醇，這些實驗一般在 1L罐的水平上，而且采用的原料多為葡萄糖，并且丁醇比停留在60-70%之間。 同時傳統意義上的丙酮丁醇生產以玉米粉為原料進行發酵，造成發酵廢醪的 C0D高，對環境造成了不良影響。
技術實現思路
本專利技術所要解決的技術問題之一在于開發具有新的性能的丙酮丁醇菌 株，它能夠快速利用淀粉，溶劑量高，發酵廢醪的C0D低。本專利技術所要解決的技術問題之二在于提供所述丙酮丁醇菌株的篩選方法。本專利技術所要解決的技術問題之三在于提供所述丙酮丁醇菌株的用途。作為本專利技術第一方面的丙酮丁醇菌株，其特征在于它是丙酮丁醇梭菌 (Clostridium acetobutylicum)菌株RAB3226，屬于丙酮丁醇梭菌CICC 8011 的突變株，保藏號為CCTCCN0: M207199，保藏日期2007. 12.14，保藏單位 中國典型培養物保藏中心，中國、武漢、武漢大學。作為本專利技術第二方面的丙酮丁醇菌株的篩選方法，是以丙酮丁醇梭菌 (Clostridium acetobutylicum)為出發菌株，采取了化學誘變，并利用淀粉平 板和丁醇結構類似物平板，進行雙平板篩選，得到一株能夠利用淀粉快速發 酵生產生物丁醇的丙酮丁醇梭菌。在一實施方案里，本專利技術所述的丙酮丁醇梭菌為中國工業微生物菌種保 藏中心編號CICC 8011的丙酮丁醇梭菌株。在一實施方式里，本專利技術所述的篩選方法的具體篩選步驟如下a) 初篩菌種保藏的丙酮丁醇菌活化培養，得到生長旺盛、菌形粗壯的 菌液；吸取菌液經淀粉平板初篩，挑選出透明圈大和出現時間早的菌株；單 菌落接入種子培養基擴大培養，然后在發酵培養基中發酵，篩出總溶劑量高 的菌落；b) NTG誘變亞硝基胍誘變劑(NTG濃度10-50ug/ml)處理初篩的菌 種，10畫20min;c) 淀粉平板篩選吸取NTG處理的菌液經淀粉平板篩選，挑選透明圈 大和出現時間早的菌株；d) 高丁醇比菌種的篩選淀粉平板篩選出的單菌點植于2-丁醇平板，挑 選生長旺盛的菌落；e) 試管發酵篩選將步驟d)篩出的菌落接入種子培養基擴大培養，然后 在發酵培養基中試管發酵，挑選滿足溶劑量18-23g/L， 丁醇比68-80%的兩個 條件的菌株。f) 穩定性試驗將步驟e)篩出的菌落接入發酵培養基中連續傳代32次， 傳代溫度35-40°C;經過32次傳代，挑選發酵指標滿足18-23g/L， 丁醇比 68-80%的兩個條件的菌株作為目的菌株。在上述篩選方法中，步驟a)和c)中所述淀粉平板采用下列重量比的原 料和步驟制備出葡萄糖0-2%，糊化淀粉1-6%,牛肉膏0.1-2%，蛋白胨 0.01-0.1%，磷酸二氫鉀0-0.1%，氯化鈉0-0.1%，硫酸亞鐵0-0.05%，硫酸鈣 0-0.5%,瓊脂2%，用5M的NaOH調節pH5.5-6.0，原料加熱溶解于水，滅菌， 制備平板；配置0.01-0.5%的碘溶液，濾膜除菌，在平板上均勻涂布碘溶液， 使整個平板培養基呈蘭色。步驟b)中所述NTG濃度優選40ug/ml。步驟d)中所述2-丁醇平板采用下列重量比的原料和步驟制備出葡萄 糖0-2%，糊化淀粉1-6%,牛肉膏0.1-2%，蛋白胨0.01-0.1%，磷酸二氫鉀 0-0.1%,氯化鈉0-0.1%，硫酸亞鐵0-0.05°/。，硫酸鈣0-0.5%，瓊脂2%， pH5.5-6.0; 原料加熱溶解于水，滅菌，培養基尚處于融化態加入無菌的2-丁醇，2-丁醇 在培養基中的濃度為1.0-2.5%,混勻后制備平板。 所述種子培養基采用下列重量比的原料制備出葡萄糖3-7%,牛肉膏0.1-2%，蛋白胨0.01-0.1%,磷酸二氫鉀0-0.1%，氯化鈉0-0.1%，硫酸亞鐵 0-0.05%，硫酸l丐0-0.5%， pH5.5-6.0。所述發酵培養基采用下列重量比的原料和步驟制備出糊化淀粉5-8%， 牛肉膏0.1-2%,蛋白胨0.01-0.1%，磷酸二氫鉀0-0.1%，氯化鈉0-0.1%,硫 酸亞鐵0-0.05%，硫酸f丐0-0.5%， pH5.5-6.0。作為本專利技術第三方面的丙酮丁醇菌株的用途，其主要是在生產丁醇中的應用。本專利技術通過NTG誘變、淀粉透明圈和丁醇結構類似物雙平板篩選，開發 具有新的性能的丙酮丁醇生產菌株，它能夠快速利用淀粉，溶齊jj量高，丁醇 比高，發酵廢醪的COD低，解決了傳統工藝上以玉米粉為原料廢醪COD高 的問題，對環境更友好。附圖說明圖1為本專利技術丙酮丁醇菌株的篩選方法的流程圖。具體實施例方式本專利技術對部分術語定義如下"種子培養基"是供微生物發芽、生長和大量繁殖菌絲體，并使菌體長 得粗壯，成為活力強的"種子"。所以種子培養基的營養成分要求比較豐富 和完全，氮源和維生素的含量也要高些，但總濃度以略稀薄為好，這樣可達 到較高的溶解氧，供大量菌體生長繁殖。種子培養基的成分要考慮在微生物 代謝過程中能維持穩定的pH，其組成還要根據不同菌種的生理特征而定。 一般種子培養基都用營養豐富而完全的天然有機氮源，因為有些氨基酸能刺 激孢子發芽。但本文檔來自技高網...

【技術保護點】
丙酮丁醇菌株，其特征在于它是丙酮丁醇梭菌菌株ＲＡＢ３２２６，保藏號為ＣＴＣＣ　Ｍ２０７１９９。

【技術特征摘要】

【專利技術屬性】
技術研發人員：李乃強，廖錦繡，俞宏峰，
申請(專利權)人：上海凱賽生物技術研發中心有限公司，上海凱賽生物科技有限公司，凱賽生物產業有限公司，
類型：發明
國別省市：31[中國|上海]