一種海南斑等蝎抗菌肽及制備方法和應(yīng)用技術(shù)

一種海南斑等蝎抗菌肽重組大腸桿菌，其特征在于：蝎毒抗菌肽重組大腸桿菌Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　　ｃｏｌｉ　　ＤＨ５ａ／ＩｍＡＭＰ↓［１］，ＣＣＴＣＣ　　ＮＯ：Ｍ２０７０３４。

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】

本專利技術(shù)屬于生物
，本專利技術(shù)涉及一種海南斑等蝎毒抗菌肽，還涉及該抗菌肽基因的制備方法，同時(shí)還涉及該基因的用途，高活性抗菌肽的分子設(shè)計(jì)和抗菌功能鑒定。具體地說，本專利技術(shù)涉及一種海南斑等蝎抗菌肽基因的分離鑒定；涉及一種蝎抗菌肽的抗菌譜鑒定采用化學(xué)合成手段生產(chǎn)的海南斑等蝎毒抗菌肽對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌具有廣譜抗性，而革蘭氏陰性菌無(wú)作用；涉及蝎抗菌肽對(duì)臨床分離的耐藥溶血性葡萄球菌有效；還涉及一種蝎抗菌肽的高活性分子設(shè)計(jì)和抗菌功能鑒定分子設(shè)計(jì)的蝎抗菌肽不但提高了對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌的抑菌效果，而且對(duì)革蘭氏陰性菌也有了抗性，具有潛在抗菌藥物開發(fā)的價(jià)值。
技術(shù)介紹
抗生素耐藥性問題已成為全球關(guān)注的焦點(diǎn)。中國(guó)是世界上濫用抗生素較為嚴(yán)重的國(guó)家，耐藥菌引起的醫(yī)院感染人數(shù)，已占到住院感染患者總?cè)藬?shù)的百分之三十左右。耐藥菌另一個(gè)危害是可以在不同地區(qū)、國(guó)家之間的人群之間傳播。肺炎鏈球菌是引起細(xì)菌性肺炎的常見病源菌，近年來肺炎鏈球菌對(duì)抗生素耐藥性呈上升趨勢(shì)，并已出現(xiàn)多重耐藥菌株，是臨床感染控制中棘手的難題。大量研究表明，在感染病菌或可能導(dǎo)致病菌感染(注射細(xì)菌或真菌，體壁損傷等)的情況下，昆蟲能快速合成大量抗菌肽，迅速殺滅已侵入的病菌，并阻止病菌的繼續(xù)侵染。到目前為止，在昆蟲中已發(fā)現(xiàn)了大量的抗細(xì)菌肽，抗真菌肽，以及既抗真菌又抗細(xì)菌的抗菌肽。這些抗菌肽不僅對(duì)細(xì)菌、真菌有廣譜抗菌能力，對(duì)病毒、原蟲及癌細(xì)胞也有作用。此外，還有作用機(jī)制獨(dú)特，對(duì)高等動(dòng)物正常細(xì)胞無(wú)害等特點(diǎn)，在面臨抗藥性和篩選新的抗生素極端困難的情況下，昆蟲抗菌肽可能成為抗生素的新來源。蝎子是我國(guó)的一種傳統(tǒng)名貴中藥，2000多年前就記載了蝎子的藥用史。明朝《本草綱目》更詳細(xì)記載蝎主治“諸風(fēng)癮疹、中風(fēng)、半身不遂、口眼歪斜、語(yǔ)澀、手足抽摯，小兒驚癇風(fēng)搐”等多種疾病，具有抗腫瘤，殺蟲，抑菌和抗菌功效，其作用主要來源于蝎尾毒腺分泌的毒液。毒液的主要成分是一類由10-100個(gè)氨基酸組成的具有多種生物活性的小分子多肽，它們可以選擇性、特異性的與細(xì)胞膜上的膜蛋白相互作用，從而改變細(xì)胞對(duì)離子的通透能力，調(diào)節(jié)細(xì)胞體積、pH、膜電位、興奮性等多種細(xì)胞代謝過程和細(xì)胞分泌、激素作用和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等多種生理過程。據(jù)估計(jì)，約有100000種不同生物活性肽存在于各種蝎毒腺中。因此，蝎毒素具有重要的理論研究意義和應(yīng)用開發(fā)價(jià)值。對(duì)東亞鉗蝎有實(shí)驗(yàn)研究表明，全蝎乙醇提取物在體外對(duì)8種表淺致病真菌均有抑制作用，尤其對(duì)裴氏著色菌、中克氏孢子絲菌、石膏樣毛癬菌、絮狀表皮癬菌較為敏感，其抗真菌作用優(yōu)于大蒜浸出液。曾憲春等從我國(guó)東亞鉗蝎毒腺中分離到了一個(gè)抗菌肽基因BmKn2，發(fā)現(xiàn)該蝎毒肽具有抗大腸桿菌、枯草芽孢桿菌的功能(Zeng X C，Wang S X，Zhu Y，Zhu S Y，Li W X.Identification andfunctional characterization of novel scorpion venom peptides with nodisulfide bridge from Buthus martensii Karsch.Peptides，2004，25143-150.)，本專利技術(shù)獲得的ImAMP1是從海南斑等蝎毒腺中分離的一新基因。同時(shí)，目前涉及海南斑等蝎毒素基因的專利還沒有，而涉及東亞鉗蝎毒腺毒素基因的專利僅有7項(xiàng)①東亞鉗蝎毒素BmKAS在制藥中的應(yīng)用，該專利技術(shù)涉及東亞鉗蝎毒素BmKAS在制備抗外周傷害藥中的應(yīng)用，以及東亞鉗蝎毒素BmKAS在制備抗痛覺過敏藥中的應(yīng)用；②一種含有雙價(jià)抗蟲基因的重組桿狀病毒，該專利技術(shù)涉及東亞鉗蝎昆蟲特異性神經(jīng)毒素基因BmKIT與一種昆蟲幾丁質(zhì)酶基因(Chi)，獲得含雙價(jià)抗蟲基因的重組桿狀病毒AcNPV-BmKIT-Chi；③蝎抗心律失常肽重組大腸桿菌及其構(gòu)建方法，該專利技術(shù)涉及了一種蝎抗心律失常肽BmKIM基因重組大腸桿菌，用于大量生產(chǎn)可溶、具有抗心律失常活性的重組肽；④蝎抗心律失常肽及其制備方法和應(yīng)用，該專利技術(shù)公開了一種蝎抗心律失常肽BmKIM及其制備方法和應(yīng)用，本專利技術(shù)所得到的重組BmKIM多肽具有高效抗心律失常活性，且可溶性好，產(chǎn)量高；⑤一種人工合成的蝎氯離子通道神經(jīng)毒素基因-rBmKCTa，該專利涉及到氯離子通道神經(jīng)毒素BmKCT基因，采用基因工程所得的改良的重組蝎氯離子通道神經(jīng)毒素對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞具有抑制作用，可用于制備通過抑制神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞可以治療的疾病的藥物；⑥一種過渡型蝎毒素BmKabT的用途，本專利技術(shù)公開了的過渡型蝎毒素BmKabT的用途，它可以作為一個(gè)獨(dú)特的鈉通道調(diào)制劑，研究鈉通道組成、結(jié)構(gòu)和功能的探針，可調(diào)節(jié)和治療鈉通道相關(guān)疾病的調(diào)制劑和藥品，可制備調(diào)節(jié)或治療高血鉀性麻痹、先天性肌強(qiáng)直及其它骨骼肌疾病、第三類長(zhǎng)QT間隔癥(LQT3)、原發(fā)性心室纖顫及其他心臟疾病的調(diào)制劑或藥品；⑦一種重組蝎昆蟲毒素及其可溶性表達(dá)和純化方法，該專利技術(shù)涉及一種重組蝎昆蟲毒素rBmKIT及其可溶性表達(dá)和純化方法。盡管①②③④⑤⑥⑦專利都是關(guān)于東亞鉗蝎毒素的內(nèi)容，而本專利技術(shù)中所使用的蝎子為海南斑等蝎，專利涉及的蝎毒素基因BmKAS、BmKIT、BmKIM、BmKCT、BmKabT與本專利技術(shù)獲得的ImKAMP1基因是完全不同的毒素基因，并且①②③④⑤⑥⑦專利專利技術(shù)都沒有涉及到蝎毒素的抗菌功能。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
本專利技術(shù)的目的是在于提供一種海南斑等蝎抗菌肽基因，具有抗菌功能。本專利技術(shù)的另一個(gè)目的還在于提供一種海南斑等蝎蝎毒抗菌肽，抗菌效果佳。本專利技術(shù)的再一個(gè)目的是在于提供一種制備的海南斑等蝎抗菌肽的方法，方法易行，操作簡(jiǎn)單，制備的突變體提高了抗菌效果。本專利技術(shù)的再一個(gè)目的是在于提供一種海南斑等蝎抗菌肽在制備治療或預(yù)防革蘭氏細(xì)菌的藥物中的應(yīng)用。為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本專利技術(shù)采用以下技術(shù)措施①構(gòu)建了一個(gè)高質(zhì)量海南斑等蝎毒腺組織cDNA文庫(kù)，首先取海南斑等蝎的毒腺；其次是提取總RNA，并純化mRNA；第三是反轉(zhuǎn)錄合成雙鏈cDNA；第四是雙鏈cDNA與載體pSPORT1的連接(采用T4DNA連接酶)；第五是重組分子的電轉(zhuǎn)化；第六是獲得毒腺細(xì)胞cDNA文庫(kù)；②以第一步毒腺組織cDNA文庫(kù)為基礎(chǔ)，通過PCR的方法篩選到了一個(gè)克隆子A165(編號(hào))，序列分析為一種抗菌肽基因，命名為ImAMP1，該菌保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，地址中國(guó).武漢.武漢大學(xué)，保藏日期2007年4月3日，保藏編號(hào)CCTCC NOM207034，分類命名大腸桿菌DH5α/ImAMP1(Escherichia coli DH5α/ImAMP1)；③采用化學(xué)合成的方法(由上海科肽生物科技有限公司合成)，獲得了蝎毒抗菌肽ImAMP1，抗菌試驗(yàn)結(jié)果表明，ImAMP1對(duì)革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌蘇云金芽孢桿菌(最小抑菌濃度MIC為25μg/ml)、枯草芽孢桿菌(MIC為50μg/ml)、金黃色葡萄球菌(MIC為25μg/ml)具有不同濃度的抑制作用，而對(duì)革蘭氏陰性細(xì)菌大腸桿菌(100μg/ml無(wú)作用)和銅綠假單胞菌(100μg/ml無(wú)作用)無(wú)效。該蝎毒抗菌肽ImAMP1對(duì)革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌具有特異性；④分子設(shè)計(jì)了ImAMP1的突變體ImAMP1-M，抗菌試驗(yàn)表明，該蝎毒抗菌肽的突變體ImAMP1-M提高了對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌(對(duì)枯草芽孢桿菌MIC為25μg/ml和對(duì)金黃色葡萄球菌本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一種海南斑等蝎抗菌肽重組大腸桿菌，其特征在于：蝎毒抗菌肽重組大腸桿菌ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉＤＨ５ａ／ＩｍＡＭＰ↓［１］，ＣＣＴＣＣＮＯ：Ｍ２０７０３４。

【技術(shù)特征摘要】

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：曹志賤，李文鑫，吳英亮，馬一保，戴潮，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：武漢大學(xué)，
類型：發(fā)明
國(guó)別省市：83