用蘋果酸酶活性減弱的埃希氏菌生產L-賴氨酸或L-蘇氨酸的方法技術

一種具有產Ｌ－賴氨酸或Ｌ－蘇氨酸能力的埃希氏菌，經修飾使其胞內的蘋果酸酶不能正常發揮功能；以及一種生產Ｌ－賴氨酸或Ｌ－蘇氨酸的方法，包括在培養基中培養細菌以生產和積累Ｌ－賴氨酸或Ｌ－蘇氨酸，并從培養基中收集Ｌ－賴氨酸或Ｌ－蘇氨酸。（*該技術在2024年保護過期，可自由使用*）

【技術實現步驟摘要】
【國外來華專利技術】
本專利技術涉及使用埃希氏菌(Escherichia bacterium)生產L-賴氨酸或L-蘇氨酸的方法。L-賴氨酸和L-蘇氨酸是必需氨基酸，并且是藥物組合物和多種營養混合物的有效成分，比如動物飼料添加劑。
技術介紹
產L-氨基酸細菌，如具有產L-氨基酸能力的棒狀桿菌(coryneformbacteria)或者埃希氏菌，已被用來通過發酵工業化生產L-氨基酸如L-賴氨酸和L-蘇氨酸。為提高生產能力，從自然界分離出的菌株、其人工突變株或其中L-氨基酸生物合成酶活性通過基因重組得到提高的重組菌株已被用作L-氨基酸生產菌株。在專利文獻1-4中例舉了L-賴氨酸的生產方法。在專利文獻5-8中例舉了L-蘇氨酸的生產方法。提高諸如L-賴氨酸和L-蘇氨酸的氨基酸生產能力的方法包括修飾呼吸鏈途徑以提高能量(轉換)效率(專利文獻13)，提高煙酰胺核苷酸轉移脫氫酶活性以提高產煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP)的能力(專利文獻9)，以及提高內源的生物合成途徑中某個酶的表達量的方法。另外，修飾氨基酸生物合成系統中的共同途徑的方法也是已知的，包括修飾產L-氨基酸細菌的回補途徑，如丙酮酸羧化酶活性被提高的產L-賴氨酸棒狀桿菌(專利文獻10)，丙酮酸激酶缺陷的產L-賴氨酸埃希氏菌(專利文獻11)，蘋果酸奎寧氧化還原酶缺陷的產L-賴氨酸棒狀桿菌(專利文獻12)。蘋果酸酶是回補途徑中的一個酶。已知在埃希氏菌中，sfcA和b2463基因都編碼蘋果酸酶(非專利文獻9)。但是，尚未見報道降低sfcA和b2463基因編碼的蘋果酸酶活性對提高L-賴氨酸或L-蘇氨酸的產量是否有效。代謝流量分析，也指代謝流量平衡分析，是一種預測胞內代謝流量分布的技術，它是通過胞內生化反應的化學計量模型的建立和線性優化加以實現。這項技術已被應用于研究微生物生化反應系統的能力和預測在不同外部條件下胞內代謝流量的分布(非專利文獻1、2和3)。構建大腸桿菌(Escherichia coli)的化學計量模型也有報道(非專利文獻4、5)。在谷氨酸棒狀桿菌(Corynebacterium glutamicum)生產賴氨酸的代謝工程中也有應用這種化學計量模型的實例(非專利文獻6)。另外，大量理論性和實驗性的代謝流量分析方法及其應用也有報道(非專利文獻7、8，專利文獻14、15和16)。專利文獻14公開了一種基于化學計量模型來預測生長必需基因的方法。專利文獻15公開了一種通過細胞遺傳和進化上的改變賦予細胞最適功能的技術。此外，專利文獻16公開了應用化學計量模型來解決定性的動力學信息、定性的控制信息和基于不同條件下DNA微陣列實驗數據中所存在的局限。盡管所有這些方法都是預測得到更多所需的胞內代謝流量分布，但是還沒有一種公開直接以提高細胞物質生產為目標，從理論上預測特定流量的方法。<專利文獻1> 日本專利申請公開No.10-165180<專利文獻2> 日本專利申請公開No.11-192088<專利文獻3> 日本專利申請公開No.2000-253879<專利文獻4> 日本專利申請公開No.2001-57896<專利文獻5> 日本專利申請公開No.5-304969 <專利文獻6> 國際公布No.WO98/04715<專利文獻7> 日本專利申請公開No.5-227977<專利文獻8> 美國專利申請公布No.2002/0110876<專利文獻9> 日本專利2817400<專利文獻10> 日本專利申請公開No.2002-508921<專利文獻11> 國際公布No.WO03/008600<專利文獻12> 美國專利申請公布No.2003/0044943<專利文獻13> 日本專利申請公開No.2002-17363<專利文獻14> 國際公布No.WO00/46405<專利文獻15> 國際公布No.WO02/061115<專利文獻16> 國際公布No.WO02/055995<非專利文獻1> Varma，A.and Palsson，B.O.Appl.Environ.Microbiol.603724-3731，1994<非專利文獻2> Schilling，C.H.et al.，Biotechnol.Prog.，15288-295，1999<非專利文獻3> Schilling，C.H.et al.，Biotechnol.Prog.，15296-303，1999<非專利文獻4> Pramanik，J.and Keasling，J.D.，Biotechnol.Bioeng.，56398-421，1997<非專利文獻5> Ibarra，R.U.et al.，Nature，420186-189，2002<非專利文獻6> Vallino，J.J.and Stephanopoulos，G.，Biotechnol.Bioeng.，41633-646，1993<非專利文獻7> Wiechert，W.，Journal of Biotechnology，9437-63，2002<非專利文獻8> Wiechert，W.，Metabolic Engineering，3195-205，2001<非專利文獻9> van der Rest，M.E.，Frank C.，Molenaar，D.J.，J.Bacteriol.，182(24)6892-6899，2000專利技術公開本專利技術提供了產L-賴氨酸或L-蘇氨酸能力提高的埃希氏菌，同時提供了應用這種細菌生產L-賴氨酸或L-蘇氨酸的方法。本專利技術的專利技術者們為解決這個問題進行了艱苦的研究，最終他們發現能這樣確定影響物質生產的代謝流量(1)根據從底物到目標產物的生化反應式計算得到的化學計量矩陣自由度，選擇與該矩陣自由度同樣數目的自由流量；(2)基于這個化學計量矩陣，對足夠進行統計分析的自由流量進行隨機組合，計算代謝流量分布；(3)基于統計分析從計算出的代謝流量分布得到一個回歸方程，它包含與物質生產相關的最小數目的自由流量。使用這種方法確定L-賴氨酸或L-蘇氨酸生產菌的代謝流量，揭示出經修飾使蘋果酸酶不能正常發揮功能對提高該菌株的生產能力是有效的。本專利技術基于上述發現完成并提供以下 (1)一種具有產L-賴氨酸或L-蘇氨酸能力的埃希氏菌(Escherichiabacterium)，并且其中所述細菌經修飾使蘋果酸酶在細胞內不能正常發揮功能。(2)上述(1)的本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種具有產Ｌ－賴氨酸或Ｌ－蘇氨酸能力的埃希氏菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｂａｃｔｅｒｉｕｍ），并且其中所述細菌經修飾使蘋果酸酶在細胞內不能正常發揮功能。

【技術特征摘要】
【國外來華專利技術】...

【專利技術屬性】
技術研發人員：S凡迪恩，巖谷真太郎，臼田佳弘，松井和彥，中井勇太，鈴木智子，守屋美加，辻雄一郎，植田拓嗣，
申請(專利權)人：味之素株式會社，
類型：發明
國別省市：JP[日本]