一種利用纖維堆囊菌高效生產埃博霉素的方法技術

本發明專利技術公開了一種利用纖維堆囊菌高效生產埃博霉素的方法。本發明專利技術通過對纖維堆囊菌的發酵培養基進行改良，并添加環式糊精或環式糊精的衍生物到發酵培養基中，使得發酵培養基更加適合菌體生長，埃博霉素的產量更高。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及微生物領域，具體的說涉及一種埃博霉素的高效生產方法。
技術介紹
粘細菌(Myxobacteria)是最高等的革蘭氏陰性原核生物類群，具有復雜的多細胞行為，在細胞分化、發育和生物進化研究中占有重要地位。粘細菌可產生異常豐富的次級代謝產物，而且產物生物活性作用的多樣性可以與著名的鏈霉菌類群相比擬，在微生物新藥的開發研究中是極好的菌種資源。纖維堆囊菌(Sorangium cellulosum)屬于粘細菌的溶纖維素類群，它產生的大環類酯類化合物埃博霉素(epothilone)具有促微管聚合的活性，是目前引起醫藥界廣泛關注的抗癌物質。Epothilone能與真核細胞中的微管骨架結合，導致染色體分離受阻，細胞核不能分裂，作用的有效濃度為10～20ng/ml。Epothilone最早在纖維堆囊菌Sorangium cellulosum90菌株中發現。是由纖維素堆囊菌(Sorangium cellulosum)分泌的一類大環內酯類化合物，目前發現有兩種天然衍生物，分別稱為埃博霉素A(分子式C26H39NO6S)與埃博霉素B(分子式為C27H39NO6S)，分子結構如式(I)所示。它們的外觀如無色的油，在乙酸乙酯中結晶形成粉末。 埃博霉素(Epothilones)有與紫杉醇(Taxol)相似的作用機制，對治療癌癥有較好的療效。但Epothilones與紫杉醇相比有如下優點。1.Epothilones的結構比紫杉醇更為簡單，其離體抑制的效果比紫杉醇強2000～5000倍，并且帶甲基的B的作用效果比A基本上大2倍。2.Epothilones有更好的水溶性，且更易通過發酵來獲得。3.Epothilones不是P2糖蛋白的底物，對多藥耐藥細胞有很強的細胞毒性。因而埃博霉素的抗腫瘤性能不但要比紫杉醇的強得多，而且其抗腫瘤譜可能廣得多。Epothilones有顯著選擇性的抗乳腺腫瘤細胞與結腸腫瘤細胞的活性。4.施用紫杉醇會伴隨一些臨床的副作用(如中性白細胞減少癥、外周神經病變、脫發與過敏反應)。目前已有一些關于纖維堆囊菌株在發酵罐進行發酵合成Epothilones的實驗的報道，以及關于影響Epothilones合成的營養控制的研究，但是現有Epothilones的生產方法普遍存在產量不穩定以及其產量偏低等問題。為了達到Epothilones用于制藥的目的，就必須得到足夠量的含有Epothilones的發酵液混合物。至今為止，在粘細菌特別是其Soce90菌株中提取Epothiliones已經在文獻中有所報道。為了能提取到相對高濃度的Epothilones，以前在即將提取的發酵培養基中經常加入以聚苯乙烯為材料的樹脂，例如AmberliteXAD-1180。然而這種方法的缺點在于，在大規模的應用中會引發一系列的問題。發酵罐的閥門會被樹脂小球損害；管道可能會堵塞并且儀器可能會由于機械摩擦力而導致更大的磨損。樹脂是多孔滲水物質，因此會有較大的內表面積(大約825m2/g)，在高壓滅菌的過程中，內部的空氣就無法一起被滅菌。所以在實際大規模應用中，就不能用添加樹脂的方法。但是，如果不添加樹脂，在發酵培養基中又難以提取到較高濃度的Epothiliones。目前為止，從粘細菌中獲得Epothiliones并應用于工業技術生產領域而又沒有上述缺點的方法，仍處于尋求階段。
技術實現思路
本專利技術的目的在于針對現有埃博霉素生產方法存在的各種問題，提供。纖維堆囊菌購于German Collection of Microorganisms and Cell Cultures(DSMZ，Brauuschweig，Germany)，通過對其發酵培養基進行改良，并添加環式糊精或環式糊精的衍生物到發酵培養基中，使得發酵培養基更加適合菌體生長，Epothiliones的產量更高。由于環式糊精分子內存在疏水的空穴，而分子外親水，這樣不僅可以吸附產物同時不影響菌體的生長，還可以減弱產物抑制的現象。此外能將Epothiliones從發酵液中提取出來。本專利技術利用纖維堆囊菌生產埃博霉素的方法，具體包括如下步驟(1)前培養將已滅菌的培養基G52加入到搖瓶中，然后接入纖維堆囊菌到搖瓶中培養，培養時間為3～4天，培養條件為120～250rpm，29～31℃；所述培養基G52為干酵母粉 2g/LMgSO41g/LCaCl21g/L脫脂奶粉 2g/L馬鈴薯淀粉88/L無水葡萄糖2g/LEDTA-Fe(III)-Na 1ml/L調pH至7.4，120℃滅菌20分鐘；前培養的目的在于活化菌種，培育菌種。(2)中間培養將已滅菌的培養基G52加入到發酵槽中，然后接入前培養物到發酵槽中培養，培養時間為3～4天，培養條件為29～31℃，200～300rpm，通風量為每升液體培養基每分鐘0.5升空氣，120～122℃，pH7.4；中間培養的目的在于使菌種生長進入對數生長期，為接下來的發酵培養做好準備。(3)發酵培養在發酵罐中加入已滅菌的1B12改良培養基，接著加入已滅菌的環式糊精或其衍生物，然后將中間培養物接入發酵罐中培養，培養時間為6～7天，培養條件為20～35℃，120～250rpm，即可得到含有埃博霉素的發酵液；環式糊精及其衍生物的添加是以其水溶液形式添加的，糊精及其衍生物添加的量為1克糊精或其衍生物/每100ml發酵液。添加的糊精或其衍生物溶液體積為整個發酵液體積的10％。發酵液的體積包括培養基體積、糊精溶液體積和中間培養物體積。所述1B12改良培養基為馬鈴薯淀粉 20g/L胰蛋白胨 11g/LMnCl41mg/LK2HPO40.06g/LZnCl21mg/LCuSO41mg/LEDTA-Fe(III)-Na8mg/L調pH至7.8，120℃滅菌20分鐘。上述步驟(3)所述發酵培養在發酵的第三天加入添加4mg/L氨基酸和4mg/L生長因子。最佳的氨基酸是丙氨酸，最佳的生長因子是乙酸鉀。上述步驟(1)所述前培養的最佳培養條件是180rpm，30℃，搖瓶位移50mm。上述步驟(2)所述中間培養的最佳培養條件是30℃，250rpm，通風量為每升液體培養基每分鐘0.5升空氣，121℃，pH7.4。上述步驟(3)所述發酵培養的最佳培養條件是25℃，180rpm，pH7.8。上述生產埃博霉素的方法，還包括埃博霉素的分離純化，其方法為①發酵液經離心、過濾，得到的濾液與樹脂按體積比65∶1，攪拌混合，離心，得到的樹脂先用去離子水洗滌，然后用異丙醇洗滌，得到的洗滌液中加入水，萃取其中的異丙醇，剩下的水相中再用乙酸乙酯萃取，得到的乙酸乙酯萃取物在真空旋轉蒸發器中濃縮、干燥，即可得粗結晶。將所得粗結晶加入異丙醇中，振蕩，過濾，然后在真空干燥器中干燥，得到epothilones B白色晶體；對所得白色晶體進一步通過反相色譜柱RP-18柱純化，乙腈作為洗脫液，最后用乙酸乙酯∶甲苯＝2∶3的混合液來結晶，即可得到epothilone A。本專利技術與現有技術相比，具有如下有益效果1.本專利技術在發酵液中添加了環式糊精，由于環式糊精分子內存在疏水的空穴，而分子外親水，這樣不僅可以吸附產物同時不影響菌體的生長，還可以減弱產物抑制的現象。2.本專利技術改良了Epothilone的發酵培養基的成分，本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種生產埃博霉素的方法，是利用纖維堆囊菌發酵生產，其特征是通過改良纖維堆囊菌的發酵培養基。

【技術特征摘要】

【專利技術屬性】
技術研發人員：羅立新，陸一鳴，汪薇，潘力，
申請(專利權)人：華南理工大學，
類型：發明
國別省市：81[中國|廣州]