纖連蛋白搖籃分子和其庫制造技術

本發明專利技術公開了頂部和底部環結合物庫的組合，使用許多FnIII結構域(FnIII)(如FnIII

Fibronectin cradle and its library

The invention discloses a combination of the top and the bottom ring binding repository, using a number of FnIII domains (FnIII) (such as FnIII).

【技術實現步驟摘要】
纖連蛋白搖籃分子和其庫相關申請的交叉引用本申請涉及2010年7月30日提交的美國臨時專利申請第61/369,160號、2010年7月30日提交的美國臨時專利申請第61/369,203號、2010年7月30日提交的美國臨時專利申請第61/369,222號、2011年4月12日提交的美國臨時專利申請第61/474,632號、2011年4月12日提交的美國臨時專利申請第61/474,648號。前述申請各通過引用全文納入本文。關于在聯邦政府資助的研究下完成專利技術的權利聲明本專利技術部分在美國國立衛生研究院授予芝加哥大學的合約R01-GM72688和U54GM74946下由政府資助完成。政府對本專利技術部分擁有某些權利。經電子申請系統(EFS-Web)提交的序列表參考下列經USPTOEFS-WEB服務器電子提交的序列表如MPEP§1730II.B.2(a)(C)所授權和列舉，其全部內容通過引用全文納入本文以用于所有目的。所述序列表在如下電子提交的文本文件中鑒定：文件名創建時間大小(字節)636092109340Seqlist.txt2011年7月25日335,575字節
本申請涉及新III型纖連蛋白域(FnIII)多肽和制備及使用所述FnIII多肽的方法。更特定地，本專利技術涉及FnIII多肽庫，用一些FnIII結構域的CD和FG環(如FnIII07、FnIII10和FnIII14)以及β-片層的表面暴露殘基。
技術介紹
基于支架的結合蛋白在結合特異性配體靶標能力方面成為抗體的合理替代物。這些支架結合蛋白共有以下品質：具有能耐受配體結合區中多個取代的穩定框架核心。一些支架框架具有免疫球蛋白樣蛋白結構域架構，環從β夾心核心中延伸出。支架框架核心能合成改造并用于形成含不同序列變體的庫。所述庫的序列多樣性通常集中于所述蛋白的外表面如環結構或能用作配體結合域的其他外表面。已確立III型纖連蛋白域(FnIII)為產生新型結合蛋白的有效非抗體“替代”支架。作為免疫球蛋白超家族的一員，FnIII在一個分子末端有3個表面表露環，與抗體互補決定區(CDR)類似。用此支架的工程改造策略是基于通過使這些表面環的長度和氨基酸序列多樣化而生成的組合庫。所述庫中，能結合感興趣靶標的FnIII變體可用多種選擇方法分離。由于缺乏二硫鍵，所述FnIII支架提供相較常規抗體或其片段的許多優勢，能在細菌系統中容易地高表達且其相對較小。然而，需要改善的基于FnIII的多肽和生成這種多肽庫的方法。
技術實現思路
本專利技術是基于以下意外發現：除了修飾基于FnIII多肽的至少一個環區域外，修飾FnIII多肽β片層產生就靶分子而言結合能力提高的基于FnIII的結合分子。提高的結合由可用于結合靶分子的表面積增加引起，通過用β片層中的氨基酸殘基形成結合表面部分并結合靶分子。修飾β片層還能用于區分靶標。本專利技術涉及所有FnIII分子的β鏈和環修飾，如FnIII07、FnIII10和FnIII14。具體地，本專利技術涉及F和/或Cβ鏈修飾以及FnIII分子的FG環和CD環修飾，如FnIII07、FnIII10和FnIII14。因此，一方面，本專利技術涉及基于FnIII結構域的搖籃(cradle)多肽，含有至少一個環區域和至少一個非環區域中的一個或多個氨基酸取代。在一些實施方式中，所述搖籃多肽可包含2條β鏈的氨基酸取代以及FnIII的AB環、BC環、CD環、DE環、和/或FG環中的取代。在一些實施方式中，所述搖籃多肽可包含β鏈C、β鏈D、β鏈F和/或β鏈G的氨基酸取代。在一些實施方式中，所述搖籃多肽可包含2個環區域和/或2個非環區域中的一個或多個氨基酸取代，其中所述非環區域可以是β鏈C和F，所述環區域可以是CD和FG環。在一些實施方式中，所述一個或多個氨基酸取代可引入所述β鏈的搖籃殘基。在一些實施方式中，所述搖籃多肽還可包含在至少一個環和/或非環區域中插入和/或缺失至少一個氨基酸。在一些實施方式中，所述搖籃多肽還可包含在2個環和/或2個非環區域中插入和/或缺失至少一個氨基酸，其中所述非環區域可以是β鏈C和F，所述環區域可以是CD和FG環。在一些實施方式中，所述FnIII結構域可以是人纖連蛋白的第1、第2、第3、第4、第5、第6、第7、第8、第9、第10、第11、第12、第13、第14、第15或第16FnIII結構域。在一些實施方式中，所述非環區域的一個或多個氨基酸取代可能不改變FnIII結構域支架結構域和/或環區域形狀。在一些實施方式中，所述非環區域的一個或多個氨基酸取代可排除非搖籃殘基。在一些實施方式中，環CD的長度可為約3-11、約4-9或5個殘基，其中環FG的長度可為約1-10、5或6個殘基。FG環的位置1可以是Gly殘基，位置2可以是Leu、Val或Ile殘基，位置3可以是帶電或極性殘基，位置4可以是Pro殘基，位置5可以是Gly殘基，位置6可以是極性殘基。在一些實施方式中，所述環的位置3和/或5可以是Gly殘基。在一些實施方式中，所述β鏈長度可以就β鏈C為約6-14、約8-11或9個殘基且就β鏈F為約8-13、約9-11或10個殘基。在一些實施方式中，Cβ鏈的位置2、4和6處殘基可以是疏水殘基，Cβ鏈的位置1、3、5和7-9可相對野生型序列改變，其中Cβ鏈的位置1處殘基可選自Ala、Gly、Pro、Ser、Thr、Asp、Glu、Asn、Gln、His、Lys和Arg。Cβ鏈的位置3處殘基可以是疏水殘基，或可選自Ile、Val、Arg、Leu、Thr、Glu、Lys、Ser、Gln和His。Cβ鏈的位置5、7、8和9可選自Ala、Gly、Pro、Ser、Thr、Asp、Glu、Asn、Gln、His、Lys和Arg。在一些實施方式中，Fβ鏈的位置1、3、5和10處殘基可相對野生型序列改變，其中所述Fβ鏈的位置1、3、5和10處殘基可單獨選自Ala、Gly、Pro、Ser、Thr、Asp、Glu、Asn、Gln、His、Lys和Arg。Fβ鏈的位置2、4和6處殘基可以是疏水殘基。Fβ鏈的位置7處殘基可以是疏水殘基，或可選自Arg、Tyr、Ala、Thr和Val。Fβ鏈的位置8處殘基可選自Ala、Gly、Ser、Val和Pro。Fβ鏈的位置9處殘基可選自Val、Leu、Glu、Arg和Ile。在一些實施方式中，所述搖籃多肽可包含與SEQIDNO:1位置30,31,33,35,37-39,40-45,47,49,67,69,71,73,75,76,77,78,79,80,81,82,83,84,85,和/或86處一個或多個氨基酸取代對應的取代。在一些實施方式中，所述搖籃多肽可包含SEQIDNO:97位置33,35,37,39,40,41,42,43,44,45,46,47,48,70,72,74,76,79,80,81,82,83,84和/或85處一個或多個氨基酸的氨基酸取代。在一些實施方式中，所述搖籃多肽可包含SEQIDNO:129位置31,33,35,37,39,40,41,42,43,44,66,68,70,72,75,76,77,78,79,80和/或81處一個或多個氨基酸的氨基酸取代。在一些實施方式中，所述搖籃多肽可包含SEQIDNO:468、469和470所示氨基酸序本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種基于III型纖連蛋白(FnIII)結構域的搖籃多肽，包含：(i)非環區域，其中β鏈C和β鏈F各自都含有一個或多個氨基酸修飾(例如取代)；(ii)頂部環區，其中的BC、DE和/或FG環含有一個或多個修飾(例如取代)；以及(iii)底部環區，其中的AB、CD和/或EF環含有一個或多個修飾(例如取代)；其中，所述氨基酸取代包括SEQ?ID?NO:1第31、33、35、37、38、39、67、69、71、73和/或76位。

【技術特征摘要】
2010.07.30 US 61/369,160;2010.07.30 US 61/369,203;1.一種基于III型纖連蛋白(FnIII)結構域的搖籃多肽，包含：(i)非環區域，其中β鏈C和β鏈F各自都含有一個或多個氨基酸修飾(例如取代)；(ii)頂部環區，其中的BC、DE和/或FG環含有一個或多個修飾(例如取代)；以及(iii)底部環區，其中的AB、CD和/或EF環含有一個或多個修飾(例如取代)；其中，所述氨基酸取代包括SEQIDNO:1第31、33、35、37、38、39、67、69、71、73和/或76位。2.如權利要求1所述基于FnIII結構域的搖籃多肽，含有SEQIDNO:469...

【專利技術屬性】
技術研發人員：A·洛，B·E·瓦什，小出昌平，J·B·武伊齊克，小出明子，R·N·吉爾布雷思，
申請(專利權)人：諾華有限公司，芝加哥大學，
類型：發明
國別省市：瑞士,CH