一種菌渣中泰樂菌素殘留效價的檢測方法技術

一種菌渣中泰樂菌素殘留效價的檢測方法，它涉及一種菌渣中泰樂菌素殘留效價的檢測方法，該方法包括對照品溶液的制備、供試品溶液的制備，之后采用高效液相色譜?質譜聯用法以梯度洗脫的方式將上述標準品溶液和供試品溶液注入液相色譜?質譜聯用儀中，根據外標法計算泰樂菌素效價。本發明專利技術通過對色譜條件的優選及供試品、標準品制備方法的試驗，建立了菌渣中泰樂菌素的高效液相色譜?質譜聯用檢測分析方法；通過對色譜以及質譜系統的優化，建立了菌渣中泰樂菌素的檢測方法，通過方法學驗證試驗研究表明：所建立的方法準確度高、專屬性強、重現性良好，能有效檢測菌渣中泰樂菌素效價。

A method for detecting titer of titer in mushroom residue

A detection method for the residual titer of tylosin in bacterial residue, which involves a detection method for the residual titer of tylosin in the residue, which includes the preparation of the control solution and the preparation of the test solution. Then the standard solution and the test are used in a gradient elution method by high performance liquid chromatography mass spectrometry. The titer of tylosin was calculated according to external standard method by HPLC. By the optimization of the chromatographic conditions and the test of the preparation of the test products and the preparation of standard products, a method for the detection and analysis of tylosin by high performance liquid chromatography with high performance mass spectrometry was established. The results showed that the method was accurate, specific and reproducible, and could effectively detect tylosin titer in bacterial residue.

【技術實現步驟摘要】
一種菌渣中泰樂菌素殘留效價的檢測方法
本專利技術涉及菌渣的檢測檢驗
，特別是涉及一種菌渣中泰樂菌素殘留效價的檢測方法。
技術介紹
生物發酵是抗生素類藥物的主要生產方法之一，經發酵或者藥物中間體再經改造側鏈可以合成出抗生素類藥物。發酵液中經提取、凈化目標物后，產生大量菌渣，我國是抗生素生產大國，這些抗生素每年會產生大量抗生素菌渣，按照1噸抗生素產生40噸濕菌渣(含水率為70％左右)計算，2009年一年產生的濕菌渣就達600萬噸左右。由于該菌渣主要是滅活菌絲體、殘余培養基、微生物代謝產物、部分殘留效價以及提取時加入的絮凝劑，助濾劑等，如不妥善處理，菌渣中的抗生素殘留會通過引發微生物耐藥而產生潛在的環境風險和人類健康風險。在我國抗生素菌渣已被定為危險廢棄物，由于缺乏對菌渣的無害化處理工藝及安全性進行深入系統研究，目前抗生素菌渣不僅被禁止用做飼料或飼料添加劑，也不允許用作農肥，只能進行焚燒處理，但焚燒處理成本非常高。泰樂菌素已經廣泛的用于禽畜養殖業中，是目前國際上廣泛使用的獸用抗生素之一，是使用最為廣泛的豬飼料添加劑。據國家農業部統計，目前國際市場對泰樂菌素年需求量在1500噸左右，國內的年需求量為200噸。據估計美國每年有590噸的泰樂菌素用于牛和豬的飼料添加劑。日本有50％豬飼料添加了泰樂菌素。我國泰樂菌素已使用多年，而且大量出口到國外，泰樂菌素的年出口量均超千噸。在2007年出口的抗生素原料中，獸用抗生素的出口價值占了全部抗生素出口金額的28％，數量規模占了55％。大部分獸用抗生素2007年的出口量比上年同期有所增加，而硫酸黏桿菌素、泰樂菌素和吉他霉素的同比增長率較為顯著。菌渣的無害化處理問題已嚴重影響到當前我國抗生素制藥行業的健康發展，盡快研發抗生素菌渣無害化處理與資源化生產工藝，已刻不容緩。現有的方法標準中并沒有完整的關于泰樂菌素菌渣中泰樂菌素殘留量的檢測方法。
技術實現思路
本專利技術的目的是為了提供一種菌渣中泰樂菌素殘留效價的檢測方法，以填補現有法標準中并沒有完整的關于泰樂菌素菌渣中泰樂菌素殘留量的檢測方法的空白。并解決沒有一種有效解決基質效應的影響，且現有技術無法快速/準確檢測菌渣中泰樂菌素殘留量的問題，本專利技術的一種菌渣中泰樂菌素殘留效價的檢測方法，它是按照以下步驟進行的：一、供試品樣品制備：1)稱取含有泰樂菌素菌渣，加入提取劑，渦旋振蕩1～5min后，于超聲中輔助提取20～30min，以3000～4000rpm離心5～10min，取上清液，并收集沉淀備用；2)將上步收集的沉淀，加入提取劑，渦旋振蕩1min后，于超聲中輔助提取30min，以3000～4000rpm離心10min，取上清液；3)合并步驟1)和步驟2)的上清液，將上清液于40℃水浴旋轉蒸發至原體積的1/4～1/5，得無機相，向無機相中加入甲醇溶液以及pH為5.5、濃度為0.15mol/L的乙酸鈉緩沖溶液；充分震蕩渦旋，待殘渣全部溶解后，轉移到離心管中，得待凈化樣品；4)分別移取甲醇和超純水對HLB固相萃取柱進行活化，加入上述處理所得待凈化樣品，以1mL/min速度過柱；待樣液全部流出后，用水和淋洗液依次進行淋洗，抽干所有的液體，分析物用甲醇洗脫并收集，搖勻，過0.45μm濾膜后，得供試品樣品，供液相色譜-質譜檢測；二、標準曲線繪制：用甲醇將泰樂菌素標準貯備液稀釋成質量濃度為1.00mg/L、5.00mg/L、10.00mg/L、20.00mg/L、50.00mg/L、100.00mg/L、200.00mg/L和500.00mg/L的標準工作溶液，采用高效液相色譜-質譜聯用法對上述標準工作溶液進行檢測，以測得峰面積作為縱坐標，以標準溶液濃度作為橫坐標，繪制標準曲線，并求回歸方程和相關系數；三、測定：吸取上述標準工作溶液和供試品樣品注入液相色譜-質譜聯用儀中，采用在線固相萃取-超高壓液相色譜-三重四極桿液相質譜儀對土壤中殘留泰樂菌素進行檢測，并根據外標法計算泰樂菌素殘留量；即完成所述的菌渣中泰樂菌素殘留效價的檢測；色譜條件：色譜柱：AgilentTC-C18柱，色譜柱內徑為4.6mm，柱長250mm，填料顆粒直徑為5μm，流動相：甲醇-0.1％甲酸溶液體系梯度洗脫，檢測波長：290nm，進樣量：20μL，流速：1mL/min，柱溫：30℃；質譜條件：ESI電噴霧離子源；正離子掃描模式；采集方式：MRM；子離子質荷比：173.84離子源內毛細管電壓：3.5kV；錐孔電壓：50V；去溶劑氣溫度：350℃；離子源溫度：150℃；脫溶劑氣流量：900L/Hr；錐孔氣流量：60L/hr。本專利技術包含以下有益效果：本專利技術經實驗研究，整理完善出關于泰樂菌素菌渣殘留量的固相萃取-高效液相色譜檢測方法，該方法經過驗證具有較好的重復性和實用性，為我國微生物制藥菌渣的科學有效管理、安全與最大程度資源化、實現低碳經濟與循化經濟發展提供依據。由于菌渣中含有大量菌絲體殘留、蛋白質、氨基酸以及重金屬等干擾物質，使其檢測過程中基質效應嚴重，因此本專利技術通過對泰樂菌素菌渣進行提取、濃縮、凈化等過程的探索和優化，使得菌渣中雜質物質含量被大大減少，基質干擾減弱，本研究通過提取、凈化等方式能夠高效提取泰樂菌素并去除雜質，減少基質干擾，增加檢測準確度，不僅可以保護檢測儀器同時可以準確對菌渣中泰樂菌素的含量進行檢測。本專利技術對菌渣泰樂菌素的殘留量為500～900μg/g進行，平均回收率為：80.2％～95.3％。精密度試驗的RSD為4.1％～6.0％。通過本專利技術的方法可以有效地從菌渣中提取泰樂菌素，盡最大可能降低菌渣中其他雜質對后續檢測的影響，從而提高檢測的準確度。附圖說明圖1為實施例1～500mg/L范圍內的標準曲線圖，標準曲線的回歸方程為y＝14115.03x-25366.01；R2＝0.998；圖2為實施例100mg/L的標準品測定圖；圖3為實施例100mg/L的標準品圖譜；圖4為實施例1g樣品檢測的樣品圖譜；圖5為實施例不進樣品的基線圖譜。具體實施方式具體實施方式一：本實施方式的一種菌渣中泰樂菌素殘留效價的檢測方法，它是按照以下步驟進行的：一、供試品樣品制備：1)稱取含有泰樂菌素菌渣，加入提取劑，渦旋振蕩1～5min后，于超聲中輔助提取20～30min，以3000～4000rpm離心5～10min，取上清液，并收集沉淀備用；2)將上步收集的沉淀，加入提取劑，渦旋振蕩1min后，于超聲中輔助提取30min，以3000～4000rpm離心10min，取上清液；3)合并步驟1)和步驟2)的上清液，將上清液于40℃水浴旋轉蒸發至原體積的1/4～1/5，得無機相，向無機相中加入甲醇溶液以及pH為5.5、濃度為0.15mol/L的乙酸鈉緩沖溶液；充分震蕩渦旋，待殘渣全部溶解后，轉移到離心管中，得待凈化樣品；4)分別移取甲醇和超純水對HLB固相萃取柱進行活化，加入上述處理所得待凈化樣品，以1mL/min速度過柱；待樣液全部流出后，用水和淋洗液依次進行淋洗，抽干所有的液體，分析物用甲醇洗脫并收集，搖勻，過0.45μm濾膜后，得供試品樣品，供液相色譜-質譜檢測；二、標準曲線繪制：用甲醇將泰樂菌素標準貯備液稀釋成質量濃度為1.00mg/L、5.00mg/L、10.00mg/L、20.00本文檔來自技高網...

【技術保護點】
1.一種菌渣中泰樂菌素殘留效價的檢測方法，其特征在于它是按照以下步驟進行的：一、供試品樣品制備：1)稱取含有泰樂菌素菌渣，加入提取劑，渦旋振蕩1～5min后，于超聲中輔助提取20～30min，以3000～4000rpm離心5～10min，取上清液，并收集沉淀備用；2)將上步收集的沉淀，加入提取劑，渦旋振蕩1min后，于超聲中輔助提取30min，以3000～4000rpm離心10min，取上清液；3)合并步驟1)和步驟2)的上清液，將上清液于40℃水浴旋轉蒸發至原體積的1/4～1/5，得無機相，向無機相中加入甲醇溶液以及pH為5.5、濃度為0.15mol/L的乙酸鈉緩沖溶液；充分震蕩渦旋，待殘渣全部溶解后，轉移到離心管中，得待凈化樣品；4)分別移取甲醇和超純水對HLB固相萃取柱進行活化，加入上述處理所得待凈化樣品，以1mL/min速度過柱；待樣液全部流出后，用水和淋洗液依次進行淋洗，抽干所有的液體，分析物用甲醇洗脫并收集，搖勻，過0.45μm濾膜后，得供試品樣品，供液相色譜?質譜檢測；二、標準曲線繪制：用甲醇將泰樂菌素標準貯備液稀釋成質量濃度為1.00mg/L、5.00mg/L、10.00mg/L、20.00mg/L、50.00mg/L、100.00mg/L、200.00mg/L和500.00mg/L的標準工作溶液，采用高效液相色譜?質譜聯用法對上述標準工作溶液進行檢測，以測得峰面積作為縱坐標，以標準溶液濃度作為橫坐標，繪制標準曲線，并求回歸方程和相關系數；三、測定：吸取上述標準工作溶液和供試品樣品注入液相色譜?質譜聯用儀中，采用在線固相萃取?超高壓液相色譜?三重四極桿液相質譜儀，對土壤中殘留泰樂菌素進行檢測，并根據外標法計算泰樂菌素殘留量；即完成所述的菌渣中泰樂菌素殘留效價的檢測；色譜條件：色譜柱：Agilent?TC?C18柱，色譜柱內徑為4.6mm，柱長250mm，填料顆粒直徑為5μm，流動相：甲醇?0.1％甲酸溶液體系梯度洗脫，檢測波長：290nm，進樣量：20μL，流速：1mL/min，柱溫：30℃；質譜條件：ESI電噴霧離子源；正離子掃描模式；采集方式：MRM；子離子質荷比：173.84離子源內毛細管電壓：3.5kV；錐孔電壓：50V；去溶劑氣溫度：350℃；離子源溫度：150℃；脫溶劑氣流量：900L/Hr；錐孔氣流量：60L/hr。...

【技術特征摘要】
1.一種菌渣中泰樂菌素殘留效價的檢測方法，其特征在于它是按照以下步驟進行的：一、供試品樣品制備：1)稱取含有泰樂菌素菌渣，加入提取劑，渦旋振蕩1～5min后，于超聲中輔助提取20～30min，以3000～4000rpm離心5～10min，取上清液，并收集沉淀備用；2)將上步收集的沉淀，加入提取劑，渦旋振蕩1min后，于超聲中輔助提取30min，以3000～4000rpm離心10min，取上清液；3)合并步驟1)和步驟2)的上清液，將上清液于40℃水浴旋轉蒸發至原體積的1/4～1/5，得無機相，向無機相中加入甲醇溶液以及pH為5.5、濃度為0.15mol/L的乙酸鈉緩沖溶液；充分震蕩渦旋，待殘渣全部溶解后，轉移到離心管中，得待凈化樣品；4)分別移取甲醇和超純水對HLB固相萃取柱進行活化，加入上述處理所得待凈化樣品，以1mL/min速度過柱；待樣液全部流出后，用水和淋洗液依次進行淋洗，抽干所有的液體，分析物用甲醇洗脫并收集，搖勻，過0.45μm濾膜后，得供試品樣品，供液相色譜-質譜檢測；二、標準曲線繪制：用甲醇將泰樂菌素標準貯備液稀釋成質量濃度為1.00mg/L、5.00mg/L、10.00mg/L、20.00mg/L、50.00mg/L、100.00mg/L、200.00mg/L和500.00mg/L的標準工作溶液，采用高效液相色譜-質譜聯用法對上述標準工作溶液進行檢測，以測得峰面積作為縱坐標，以標準溶液濃度作為橫坐標，繪制標準曲線，并求回歸方程和相關系數；三、測定：吸取上述標準工作溶液和供試品樣品注入液相色譜-質譜聯用儀中，采用在線固相萃取-超高壓液相色譜-三重四極桿液相質譜儀，對土壤中殘留泰樂菌素進行檢測，并根據外標法計算泰樂菌素殘留量；即完成所述的菌渣中泰樂菌素殘留效價的檢測；色譜條件：色譜柱：AgilentTC-C18柱，色譜柱內徑為4.6mm...

【專利技術屬性】
技術研發人員：王義，張鵬，金昌福，李寧飛，
申請(專利權)人：寧夏希望田野生物農業科技有限公司，
類型：發明
國別省市：寧夏,64