一種土壤中泰樂菌素殘留量的檢測方法技術

一種土壤中泰樂菌素殘留量的檢測方法，它涉及一種土壤中泰樂菌素殘留效價的檢測方法，該方法包括對照品溶液的制備、供試品溶液的制備，之后采用高效液相色譜法以梯度洗脫的方式將上述標準品溶液和供試品溶液注入液相色譜儀中，根據外標法計算泰樂菌素效價。本發明專利技術通過對色譜條件的優選及供試品、標準品制備方法的試驗，建立了土壤中泰樂菌素的高效液相色譜檢測分析方法；通過對色譜以及質譜系統的優化，建立了土壤中泰樂菌素的檢測方法，通過方法學驗證試驗研究表明：所建立的方法準確度高、專屬性強、重現性良好，能有效檢測土壤中泰樂菌素效價。

【技術實現步驟摘要】
一種土壤中泰樂菌素殘留量的檢測方法
本專利技術涉及土壤的檢測檢驗
，特別是涉及一種土壤中泰樂菌素殘留效價的檢測方法。
技術介紹
在我國，禽畜養殖業的規模越來越大，為了促進動物生長以及防病治病，抗生素使用量也隨之增加，由此而產生的抗生素濫用問題愈發嚴重。抗生素在動物體內的殘留量很少，大部分抗生素及降解產物會以糞便的形式排出體外，經過一定的處理或不作任何處理便施用于作物種植，尤其是大棚蔬菜種植，抗生素也隨之進入土壤環境，并對土壤微生物及土壤酶活性產生影響，破壞生態環境，經食物鏈作用也可能進入人體，若產生耐藥基因則會嚴重威脅人類健康。抗生素作為一種新的環境污染物所引起的危害不容忽視，必須高度重視。相關檢測發現，土壤中抗生素的含量已達到11～300μg/kg，主要是磺胺類、喹諾酮類、四環素類抗生素。建立土壤中不同種類抗生素的痕量檢測分析方法成為比較熱門的探索方向。但土壤中的抗生素主要是對于四環素類抗生素的分析檢測，泰樂菌素的檢測報道比較少見，且土壤基質不同提取和凈化條件的選擇也有所不同。泰樂菌素已經廣泛的用于禽畜養殖業中，是目前國際上廣泛使用的獸用抗生素之一，是使用最為廣泛的豬飼料添加劑。據國家農業部統計，目前國際市場對泰樂菌素年需求量在1500噸左右，國內的年需求量為200噸。據估計美國每年有590噸的泰樂菌素用于牛和豬的飼料添加劑。日本有50％豬飼料添加了泰樂菌素。我國泰樂菌素已使用多年，而且大量出口到國外，泰樂菌素的年出口量均超千噸。在2007年出口的抗生素原料中，獸用抗生素的出口價值占了全部抗生素出口金額的28％，數量規模占了55％。大部分獸用抗生素2007年的出口量比上年同期有所增加，而硫酸黏桿菌素、泰樂菌素和吉他霉素的同比增長率較為顯著。由于泰樂菌素殘留在土壤中會嚴重威脅到生態平衡，故為了研究泰樂菌素菌渣有機肥在土壤中環境行為、穩定性及衰減規律，必須首先建立土壤中泰樂菌素殘留效價的檢測方法。由于基質效應的影響，故不同于菌渣已建立的方法，需要重新建立在土壤中目標物質殘留的檢測方法。
技術實現思路
本專利技術的目的是為了解決土壤中痕量抗生素殘留的檢測問題，而提供了一種土壤中泰樂菌素殘留量的檢測方法。本專利技術的一種土壤中泰樂菌素殘留量的檢測方法，它是按照以下步驟進行的：一、供試品樣品制備：1)稱取含有泰樂菌素的土壤，加入提取劑，渦旋振蕩1～5min后，于超聲中輔助提取20～30min，以3000～4000rpm離心5～10min，取上清液，并收集沉淀備用；2)將上步收集的沉淀，加入提取劑，渦旋振蕩1min后，于超聲中輔助提取30min，以3000～4000rpm離心10min，取上清液；3)合并步驟1)和步驟2)的上清液，將上清液于40℃水浴旋轉蒸發至原體積的1/4～1/5，得無機相，向無機相中加入甲醇溶液以及pH為5.5、濃度為0.15mol/L的乙酸鈉緩沖溶液；充分震蕩渦旋，待殘渣全部溶解后，轉移到離心管中，得待凈化樣品；4)用甲醇和超純水對HLB固相萃取柱進行活化，加入待凈化樣品，以1mL/min速度過柱，待樣液全部流出后，用水和淋洗液依次進行淋洗，抽干所有的液體，分析物用甲醇洗脫并收集，搖勻，過0.45μm濾膜后，得供試品樣品；二、標準曲線繪制：用甲醇將泰樂菌素標準貯備液稀釋成質量濃度為1.00mg/L、5.00mg/L、10.00mg/L、20.00mg/L、50.00mg/L、100.00mg/L和200.00mg/L標準工作溶液，采用高效液相色譜-質譜聯用法對上述標準工作溶液進行檢測，以測得峰面積為作縱坐標，以標準工作溶液濃度作為橫坐標，繪制標準曲線，求回歸方程和相關系數；三、測定：吸取上述標準工作品溶液和供試品樣品注入液相色譜儀中，根據外標法計算泰樂菌素殘留量；采用高效液相色譜儀對土壤中殘留泰樂菌素進行測定；色譜條件：色譜柱：AgilentTC-C18柱，色譜柱內徑為4.6mm，柱長250mm，填料顆粒直徑為5μm，流動相：乙腈-0.01moL/L磷酸二氫鉀溶液等度洗脫，檢測波長：290nm，進樣量：20μL，流速：1mL/min，柱溫：30℃。本專利技術包含以下有益效果：本專利技術研究并建立了在土壤當中，泰樂菌素殘留效價的固相萃取-高效液相色譜檢測的方法。通過本專利技術的方法可以有效地從土壤中提取泰樂菌素，盡最大可能降低土壤中其他雜質對后續檢測的影響，從而提高檢測的準確度。本專利技術經實驗研究，整理完善出關于土壤中泰樂菌素殘留量的固相萃取-高效液相色譜檢測方法，該方法經過驗證具有較好的重復性和實用性，為我國微生物制藥土壤的科學有效管理、安全與最大程度資源化、實現低碳經濟與循化經濟發展提供依據。本方法當加標水平在10-200mgKg-1時，土壤的泰樂菌素平均回收率范圍為89.8％～98.7％，標準偏差范圍為7.2％～8.3％3％(n＝3)，計算得到LOD為0.069μg/mg，LOQ為0.083μg/mg。且在重復性條件下獲得的兩次獨立測定結果的絕對差值不得超過算術平均值的10％。附圖說明圖1為實施例1～200mg/kg的標準曲線圖；其中，回歸方程為y＝15148.92x-31161.68；R2＝0.998；圖2為實施例100mg/L濃度的標準品測定圖；圖3為實施例100mg/L的標準品圖譜；圖4為實施例實際土壤樣品的樣品圖譜；圖5為實施不進樣品的基線圖譜。具體實施方式具體實施方式一：本實施方式的一種土壤中泰樂菌素殘留量的檢測方法，它是按照以下步驟進行的：一、供試品樣品制備：1)稱取含有泰樂菌素的土壤，加入提取劑，渦旋振蕩1～5min后，于超聲中輔助提取20～30min，以3000～4000rpm離心5～10min，取上清液，并收集沉淀備用；2)將上步收集的沉淀，加入提取劑，渦旋振蕩1min后，于超聲中輔助提取30min，以3000～4000rpm離心10min，取上清液；3)合并步驟1)和步驟2)的上清液，將上清液于40℃水浴旋轉蒸發至原體積的1/4～1/5，得無機相，向無機相中加入甲醇溶液以及pH為5.5、濃度為0.15mol/L的乙酸鈉緩沖溶液；充分震蕩渦旋，待殘渣全部溶解后，轉移到離心管中，得待凈化樣品；4)用甲醇和超純水對HLB固相萃取柱進行活化，加入待凈化樣品，以1mL/min速度過柱，待樣液全部流出后，用水和淋洗液依次進行淋洗，抽干所有的液體，分析物用甲醇洗脫并收集，搖勻，過0.45μm濾膜后，得供試品樣品；二、標準曲線繪制：用甲醇將泰樂菌素標準貯備液稀釋成質量濃度為1.00mg/L、5.00mg/L、10.00mg/L、20.00mg/L、50.00mg/L、100.00mg/L和200.00mg/L標準工作溶液，采用高效液相色譜-質譜聯用法對上述標準工作溶液進行檢測，以測得峰面積為作縱坐標，以標準工作溶液濃度作為橫坐標，繪制標準曲線，求回歸方程和相關系數；三、測定：吸取上述標準工作品溶液和供試品樣品各10μL注入液相色譜儀中，根據外標法計算泰樂菌素殘留量；采用高效液相色譜儀對土壤中殘留泰樂菌素進行測定；色譜條件：色譜柱：AgilentTC-C18柱，色譜柱內徑為4.6mm，柱長250mm，填料顆粒直徑為5μm，流動相：乙腈-0.01moL/L磷酸二氫鉀溶液等度洗脫，檢測波長：29本文檔來自技高網...

【技術保護點】
1.一種土壤中泰樂菌素殘留量的檢測方法，其特征在于它是按照以下步驟進行的：一、供試品樣品制備：1)稱取含有泰樂菌素的土壤，加入提取劑，渦旋振蕩1～5min后，于超聲中輔助提取20～30min，以3000～4000rpm離心5～10min，取上清液，并收集沉淀備用；2)向上步收集的沉淀中加入提取劑，渦旋振蕩1min后，于超聲中輔助提取30min，以3000～4000rpm離心10min，取上清液；3)合并步驟1)和步驟2)的上清液，將上清液于40℃水浴旋轉蒸發至原體積的1/4～1/5，得無機相，向無機相中加入甲醇溶液以及pH為5.5、濃度為0.15mol/L的乙酸鈉緩沖溶液；充分震蕩渦旋，待殘渣全部溶解后，轉移到離心管中，得待凈化樣品；4)用甲醇和超純水對HLB固相萃取柱進行活化，加入待凈化樣品，以1mL/min速度過柱，待樣液全部流出后，用水和淋洗液依次進行淋洗，抽干所有的液體，分析物用甲醇洗脫并收集，搖勻，過0.45μm濾膜后，得供試品樣品；二、標準曲線繪制：用甲醇將泰樂菌素標準貯備液稀釋成質量濃度為1.00mg/L、5.00mg/L、10.00mg/L、20.00mg/L、50.00mg/L、100.00mg/L和200.00mg/L標準工作溶液，采用高效液相色譜儀對上述標準工作溶液進行檢測，以測得峰面積為作縱坐標，以標準工作溶液濃度作為橫坐標，繪制標準曲線，求回歸方程和相關系數；三、測定：吸取上述標準工作品溶液和供試品樣品注入液相色譜儀中，根據外標法計算泰樂菌素殘留量；采用高效液相色譜儀對土壤中殘留泰樂菌素進行測定；色譜條件：色譜柱：Agilent?TC?C18柱，色譜柱內徑為4.6mm，柱長250mm，填料顆粒直徑為5μm，流動相：乙腈?0.01moL/L磷酸二氫鉀溶液等度洗脫，檢測波長：290nm，進樣量：20μL，流速：1mL/min，柱溫：30℃。...

【技術特征摘要】
1.一種土壤中泰樂菌素殘留量的檢測方法，其特征在于它是按照以下步驟進行的：一、供試品樣品制備：1)稱取含有泰樂菌素的土壤，加入提取劑，渦旋振蕩1～5min后，于超聲中輔助提取20～30min，以3000～4000rpm離心5～10min，取上清液，并收集沉淀備用；2)向上步收集的沉淀中加入提取劑，渦旋振蕩1min后，于超聲中輔助提取30min，以3000～4000rpm離心10min，取上清液；3)合并步驟1)和步驟2)的上清液，將上清液于40℃水浴旋轉蒸發至原體積的1/4～1/5，得無機相，向無機相中加入甲醇溶液以及pH為5.5、濃度為0.15mol/L的乙酸鈉緩沖溶液；充分震蕩渦旋，待殘渣全部溶解后，轉移到離心管中，得待凈化樣品；4)用甲醇和超純水對HLB固相萃取柱進行活化，加入待凈化樣品，以1mL/min速度過柱，待樣液全部流出后，用水和淋洗液依次進行淋洗，抽干所有的液體，分析物用甲醇洗脫并收集，搖勻，過0.45μm濾膜后，得供試品樣品；二、標準曲線繪制：用甲醇將泰樂菌素標準貯備液稀釋成質量濃度為1.00mg/L、5.00mg/L、10.00mg/L、20.00mg/L、50.00mg/L、100.00mg/L和200.00mg/L標準工作溶液，采用高效液相色譜儀對上述標準工作溶液進行檢測，以測得峰面積為作縱坐標，以標準工作溶液濃度作為橫坐標，繪制標準曲線，求回歸方程和相關系數；三、測定：吸取上述標準工作品溶液和供試品樣品注入液相色譜儀中，根據外標法計算泰樂菌素殘留量；采用高效液相色譜儀對...

【專利技術屬性】
技術研發人員：王義，張鵬，金昌福，李寧飛，
申請(專利權)人：寧夏希望田野生物農業科技有限公司，
類型：發明
國別省市：寧夏,64