一種DNA免疫吸附劑及其制備方法技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)公開了一種DNA免疫吸附劑及其制備方法。該制備方法包括如下步驟：1)含有醛基的聚苯乙烯基大孔吸附樹脂的制備：2)DNA配基接枝固載。通過該方法制備的DNA免疫吸附劑直接采用大孔吸附樹脂作為載體，用大孔吸附樹脂替代活性炭或碳化樹脂，由于生產(chǎn)過程中減少了炭化和活化工藝，保留了樹脂骨架的韌性，大幅降低了微粒脫落的風(fēng)險(xiǎn)；另外，本發(fā)明專利技術(shù)采用化學(xué)接枝法，直接將DNA配基固載到大孔吸附樹脂上，通過化學(xué)鍵連接的DNA配基固載牢固，不易脫落；此外，由于沒有火棉膠等包膜材料的包埋和掩蓋，固載在樹脂表面及孔道內(nèi)部的DNA可以發(fā)揮出最大的吸附作用。

A DNA immunosorbent and its preparation method

The invention discloses a DNA immunoadsorbent and a preparation method thereof. The preparation method comprises the following steps: 1) preparation of polystyrene based macroporous adsorption resin containing aldehyde group: 2) DNA ligand graft immobilization. The DNA immunization agent prepared by this method uses macroporous adsorption resin as the carrier directly, replacing activated carbon or carbonized resin with macroporous adsorption resin. Due to the reduction of carbonization and activation process, the toughness of the resin skeleton is retained and the risk of falling particles is reduced greatly. In addition, the invention is used in chemistry. The DNA ligands are immobilized onto the macroporous adsorption resin directly by grafting, and the DNA ligands connected by chemical bonds are firmly immobilized and are not easy to fall off. In addition, the maximum adsorption of DNA on the surface of the resin and the inside of the pore can be achieved because of the inclusion and concealment of the coating materials such as the colloid.

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
一種DNA免疫吸附劑及其制備方法
本專利技術(shù)涉及血液凈化領(lǐng)域，具體涉及一種能用于吸附系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者體內(nèi)致病物質(zhì)的DNA免疫吸附劑及其制備方法。
技術(shù)介紹
系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemiclupuserythematosus，SLE)是一種較常見的累及多系統(tǒng)多器官的自身免疫性疾病。由于體內(nèi)有大量致病性自身抗體和免疫復(fù)合物而造成組織損傷，臨床上可出現(xiàn)各個(gè)系統(tǒng)和臟器損傷的表現(xiàn)，如皮膚、關(guān)節(jié)，漿膜、心臟、腎臟，中樞神經(jīng)系統(tǒng)、血液系統(tǒng)等等，該病在世界范圍內(nèi)均有出現(xiàn)，患病率為4/10萬～25/10萬，亞洲及黑人患病率較高，我國的患病率為70/10萬～75/10萬。女性發(fā)病明顯多于男性，約為10∶1，育齡婦女為發(fā)病高峰，老人及兒童也可患病。其中，抗雙鏈DNA抗體(抗ds-DNA抗體)是參與SLE發(fā)病的主要抗體，其特異性可達(dá)90％，是SLE特異性抗體。近年來，在血漿置換基礎(chǔ)上發(fā)展了一種新的療法，即免疫吸附。這是通過吸附除去內(nèi)源性和外源性致病因子，凈化血液，從而達(dá)到治療目的。免疫吸附是通過抗原抗體免疫反應(yīng)或物理化學(xué)作用除去致病因子，主要是血漿吸附，從而避免了離心式和一次膜血漿分離大量丟棄血漿的弊端，因此利用血液直接吸附和血漿吸附，能特異地選擇性地吸附血漿中特定的病因物質(zhì)。根據(jù)吸附劑與被吸附物質(zhì)之間的作用原理，可以將吸附劑分為生物親和型和物化親和型。前者包括：①抗原固定型：將抗原固定在載體上，吸附除去相應(yīng)的抗體或免疫復(fù)合物；②抗體固定型：將抗體固定在載體上，吸附除去相應(yīng)的抗原；③補(bǔ)體固定型：將C1q固定在載體上，吸附除去免疫復(fù)合物；④蛋白A固定型：將蛋白A固定在載體上，吸附除去相應(yīng)的免疫球蛋白；后者包括：①靜電結(jié)合型：通過吸附劑和被吸附物之間的靜電作用而相互結(jié)合；②疏水結(jié)合型：靠吸附劑側(cè)鏈的疏水基團(tuán)與被吸附物之間的疏水作用力而結(jié)合。其中應(yīng)用比較廣泛的是DNA免疫吸附，采用免疫吸附療法可以特異性的吸附和清除抗ds-DNA抗體，從而對(duì)SLE患者進(jìn)行有效的治療。歐洲專利EP0272792A1披露了基于活性炭或者碳化樹脂的DNA免疫吸附劑制備方法，它們以活性炭或碳化樹脂為載體，以小牛胸腺DNA為配基，利用火棉膠包膜固載DNA。但是，無論是活性炭還是碳化樹脂，均存在碳顆粒易脫落的問題，即使通過火棉膠包膜，仍然無法解決微粒脫落的問題，因而使用之前需要增加時(shí)間進(jìn)行充分預(yù)沖至無微粒，從而避免治療時(shí)微粒隨血液循環(huán)進(jìn)入人體而導(dǎo)致發(fā)生血栓、過敏、刺激等嚴(yán)重的不良反應(yīng)；此外，DNA采用火棉膠包埋方式固載還存在兩個(gè)缺點(diǎn)：(1)部分DNA會(huì)由于包埋不充分，在后續(xù)生產(chǎn)過程中可能發(fā)生脫落，導(dǎo)致DNA固載量下降；(2)部分被包埋過深的DNA又無法與抗體接觸；無論是DNA固載量下降還是包埋過深都會(huì)影響吸附劑的吸附性能。因此，提供一種吸附性能好的，微粒脫落率低的DNA免疫吸附劑成為亟待解決的問題。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
本專利技術(shù)所要解決的首要技術(shù)問題在于提供一種新型DNA免疫吸附劑的制備方法。該方法直接采用大孔吸附樹脂作為載體，更安全、更有效、同時(shí)生產(chǎn)工藝更為簡單。本專利技術(shù)所要解決的另一技術(shù)問題在于提供一種根據(jù)上述方法制備的DNA免疫吸附劑。為了實(shí)現(xiàn)上述專利技術(shù)目的，本專利技術(shù)提供一種新型DNA免疫吸附劑的制備方法，包括如下步驟：1)含有醛基的聚苯乙烯基大孔吸附樹脂的制備：以乙烯基苯甲醛單體和苯乙烯類單體為原料，以多乙烯基單體為交聯(lián)劑，再加入致孔劑和引發(fā)劑，混合均勻，制成混合有機(jī)相，將混合有機(jī)相加入到分散介質(zhì)中，機(jī)械攪拌，待混合有機(jī)相在分散介質(zhì)溶液中形成一定大小的均勻液滴后，進(jìn)行懸浮聚合，反應(yīng)結(jié)束后，水洗至水洗液澄清，用丙酮抽提12-36h，再水洗至無丙酮味，抽濾，得到含有醛基的聚苯乙烯基大孔樹脂；其中，所述乙烯基苯甲醛單體占單體總重量的5％-40％；所述苯乙烯類單體占單體總重量的5-40％；所述多乙烯基單體占單體總重量的55-80％；所述致孔劑的用量為單體總重量的70％-250％；所述引發(fā)劑的用量為單體總重量的0.5％-1.5％；所述分散介質(zhì)與混合有機(jī)相的體積比為1-3∶1；所述分散介質(zhì)由分散劑和水組成；所述分散劑占分散介質(zhì)質(zhì)量百分比為0.5％-2％；具體操作時(shí)，懸浮聚合過程為：加熱升溫至70-75℃，聚合3-6小時(shí)，升溫至78-82℃反應(yīng)5-8小時(shí)，再升溫至85-90℃，繼續(xù)反應(yīng)4-8小時(shí)后停止反應(yīng)；懸浮聚合反應(yīng)總時(shí)間優(yōu)選為14-18小時(shí)；2)DNA配基接枝固載：取小牛胸腺DNA溶解于0.2mol/LpH＝7.5-8.0的Tris-HCl緩沖溶液中，配制成濃度為0.5-2mg/mLDNA溶液，將步驟1)所得的含醛基的聚苯乙烯基大孔吸附樹脂加入到相當(dāng)于樹脂質(zhì)量1-5倍的上述DNA溶液中，在60-80℃下反應(yīng)5-18h，得到接枝DNA配基的大孔吸附樹脂。其中，所述大孔樹脂的粒徑范圍為0.4-2mm，優(yōu)選為0.6-1.2mm。所述乙烯基苯甲醛單體為3-乙烯基苯甲醛或4-乙烯基苯甲醛中的一種或者兩種，優(yōu)選為4-乙烯基苯甲醛。當(dāng)乙烯基苯甲醛單體為兩種的混合物時(shí)，二者間以任意比例混合。所述的苯乙烯類單體選自苯乙烯、甲基苯乙烯、乙基苯乙烯的一種或兩種，優(yōu)選為苯乙烯、乙基苯乙烯。當(dāng)苯乙烯類單體為兩種的混合物時(shí)，二者間以任意比例混合。所述的交聯(lián)劑為多乙烯基單體，如二乙烯基苯(DVB)、二乙烯基甲苯，優(yōu)選為二乙烯基苯。所述致孔劑為芳烴、高級(jí)醇、烷烴、酯類中的一種或兩種或三種。其中，所述芳烴為甲苯或二甲苯，所述高級(jí)醇為丁醇、己醇或環(huán)己醇，所述烷烴為正庚烷、200#汽油、液體石蠟或固體石蠟，所述酯類為乙酸丁酯、乙酸乙酯或丁酸丁酯，優(yōu)選為甲苯、環(huán)己醇、液體石蠟。當(dāng)致孔劑為兩種或三種的混合物時(shí)，彼此間以任意比例混合。所述引發(fā)劑為有機(jī)過氧化物，如：過氧化苯甲酰、過氧化-2-乙基己酸叔丁酯或過氧化-2-乙基己酸叔戊酯，優(yōu)選為氧化苯甲酰。所述分散劑為明膠、聚乙烯醇或羧甲基纖維素，優(yōu)選為明膠。所述大孔吸附樹脂的比表面為300-1100m2/g，優(yōu)選為450-800m2/g；平均孔徑為4-20nm，優(yōu)選為8-15nm；醛基含量為0.5-4mmol/g，優(yōu)選為1.5-3.0mmol/g。步驟2)中所得固載DNA配基的大孔吸附樹脂中DNA的固載量為0.3-4mg/mL，優(yōu)選為1.0-3.0mg/mL。經(jīng)實(shí)驗(yàn)證明，過低的DNA的固載量會(huì)影響吸附劑的吸附性能，同時(shí)過高的固載量要求樹脂中含有更多醛基，但是過多的乙烯基苯甲醛單體會(huì)影響樹脂的孔結(jié)構(gòu)及樹脂強(qiáng)度等性能指標(biāo)。本專利技術(shù)首先制備能與小牛胸腺DNA分子發(fā)生化學(xué)反應(yīng)的大孔吸附樹脂，在苯乙烯、二乙烯基苯體系中引入乙烯基苯甲醛單體，通過自由基聚合制備含有醛基的聚苯乙烯基大孔吸附樹脂；再利用DNA上的堿基與大孔吸附樹脂上的醛基發(fā)生接枝反應(yīng)從而成功地將小牛胸腺DNA分子固載到大孔吸附樹脂上。本專利技術(shù)通過在聚苯乙烯系列樹脂的合成中引入乙烯基苯甲醛單體，成功地在大孔吸附樹脂的骨架上引入醛基；再利用DNA分子中的堿基與大孔吸附樹脂骨架上的醛基之間的化學(xué)反應(yīng)，成功地在樹脂骨架上接枝DNA分子，從而獲得了新型的DNA免疫吸附劑。該新型DNA免疫吸附劑具有以下優(yōu)點(diǎn)：(1)與活性炭或碳化樹脂相比，聚苯乙烯系列大孔吸附樹脂骨架強(qiáng)度高，微粒脫落少，可以縮短預(yù)沖時(shí)間、減少預(yù)沖液用量，節(jié)約資源，本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
1.一種DNA免疫吸附劑的制備方法，其特征在于包括如下步驟：1)含有醛基的聚苯乙烯基大孔吸附樹脂的制備：以乙烯基苯甲醛單體和苯乙烯類單體為原料，以多乙烯基單體為交聯(lián)劑，再加入致孔劑和引發(fā)劑，混合均勻，制成混合有機(jī)相，將混合有機(jī)相加入到分散介質(zhì)中，機(jī)械攪拌，待混合有機(jī)相在分散介質(zhì)溶液中形成一定大小的均勻液滴后，進(jìn)行懸浮聚合；反應(yīng)結(jié)束后，水洗至水洗液澄清，用丙酮抽提12?36h，再水洗至無丙酮味，抽濾，得到含有醛基的聚苯乙烯基大孔樹脂；其中，所述乙烯基苯甲醛單體占單體總重量的5％?40％；所述苯乙烯類單體占單體總重量的5?40％；所述多乙烯基單體占單體總重量的55?80％；所述致孔劑的用量為單體總重量的70％?250％；所述引發(fā)劑的用量為單體總重量的0.5％?1.5％；所述分散介質(zhì)與混合有機(jī)相的體積比為1?3∶1；所述分散介質(zhì)由分散劑和水組成；其中分散劑占分散介質(zhì)質(zhì)量百分比為0.5％?2％；具體操作時(shí)，懸浮聚合過程為：加熱升溫至70?75℃，聚合3?6小時(shí)，升溫至78?82℃反應(yīng)5?8小時(shí)，再升溫至85?90℃，繼續(xù)反應(yīng)4?8小時(shí)后停止反應(yīng)；2)DNA配基接枝固載：取小牛胸腺DNA溶解于0.2mol/L?pH＝7.5?8.0的Tris?HCl緩沖溶液中，配制成濃度為0.5?2mg/mL?DNA溶液，將步驟1)所得的含醛基的聚苯乙烯基大孔吸附樹脂加入到相當(dāng)于樹脂質(zhì)量1?5倍的上述DNA溶液中，在60?80℃下反應(yīng)5?18h，得到接枝DNA配基的大孔吸附樹脂。...

【技術(shù)特征摘要】
1.一種DNA免疫吸附劑的制備方法，其特征在于包括如下步驟：1)含有醛基的聚苯乙烯基大孔吸附樹脂的制備：以乙烯基苯甲醛單體和苯乙烯類單體為原料，以多乙烯基單體為交聯(lián)劑，再加入致孔劑和引發(fā)劑，混合均勻，制成混合有機(jī)相，將混合有機(jī)相加入到分散介質(zhì)中，機(jī)械攪拌，待混合有機(jī)相在分散介質(zhì)溶液中形成一定大小的均勻液滴后，進(jìn)行懸浮聚合；反應(yīng)結(jié)束后，水洗至水洗液澄清，用丙酮抽提12-36h，再水洗至無丙酮味，抽濾，得到含有醛基的聚苯乙烯基大孔樹脂；其中，所述乙烯基苯甲醛單體占單體總重量的5％-40％；所述苯乙烯類單體占單體總重量的5-40％；所述多乙烯基單體占單體總重量的55-80％；所述致孔劑的用量為單體總重量的70％-250％；所述引發(fā)劑的用量為單體總重量的0.5％-1.5％；所述分散介質(zhì)與混合有機(jī)相的體積比為1-3∶1；所述分散介質(zhì)由分散劑和水組成；其中分散劑占分散介質(zhì)質(zhì)量百分比為0.5％-2％；具體操作時(shí)，懸浮聚合過程為：加熱升溫至70-75℃，聚合3-6小時(shí)，升溫至78-82℃反應(yīng)5-8小時(shí)，再升溫至85-90℃，繼續(xù)反應(yīng)4-8小時(shí)后停止反應(yīng)；2)DNA配基接枝固載：取小牛胸腺DNA溶解于0.2mol/LpH＝7.5-8.0的Tris-HCl緩沖溶液中，配制成濃度為0.5-2mg/mLDNA溶液，將步驟1)所得的含醛基的聚苯乙烯基大孔吸附樹脂加入到相當(dāng)于樹脂質(zhì)量1-5倍的上述DNA溶液中，在60-80℃下反應(yīng)5-18h，得到接枝DNA配基的大孔吸附樹脂。2.如權(quán)利要求1所述的DNA免疫吸附劑的制備方法，其特征在于，步驟1)所述含有醛...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：董凡，邵柯，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：珠海健帆生物科技股份有限公司，
類型：發(fā)明
國別省市：廣東,44