一種菌渣中林可霉素殘留量的檢測方法技術

一種菌渣中林可霉素殘留量的檢測方法，它涉及一種菌渣中林可霉素殘留量的檢測方法，該方法包括對照品溶液的制備、供試品溶液的制備，之后采用高效液相色譜法檢測，將上述標準品溶液和供試品溶液注入液相色譜儀中，根據外標法計算林可霉素效價。本發明專利技術通過對色譜條件的優選及供試品、標準品制備方法的試驗，建立了菌渣中林可霉素的高效液相色譜檢測分析方法；通過對色譜條件和凈化工藝的優化，建立了菌渣中林可霉素的檢測方法，通過方法學驗證試驗研究表明：所建立的方法準確度高、專屬性強、重現性良好，能有效檢測菌渣中殘留林可霉素。

A method for determination of lincomycin residues in bacterial residue

A method for detecting the residue of lincomycin in the residue of bacteria, which involves a method for the detection of remnant of lincomycin in the residue of bacteria, including the preparation of the control solution and the preparation of the solution of the sample, then the high performance liquid chromatography is used to inject the above standard solution and the sample solution into the liquid chromatograph. The titer of lincomycin was calculated according to the external standard method. The method of high performance liquid chromatography for the detection and analysis of lincomycin in bacterial residue was established by the optimization of the chromatographic conditions and the test of the test products and the preparation methods of the standard products. The method of detection of lincomycin in the residue of bacteria was established by optimizing the chromatographic conditions and purification process. The established method is accurate, specific and reproducible, and can effectively detect lincomycin residues in bacterial residue.

【技術實現步驟摘要】
一種菌渣中林可霉素殘留量的檢測方法
本專利技術涉及抗生素的檢測
，特別是涉及一種菌渣中林可霉素殘留效價的檢測方法。
技術介紹
目前抗生素類藥物應用廣泛，主要應用方式是作為獸藥，其檢測主要集中在動物源性食品中。主要的檢測方法有高效液相色譜法，高效液相色譜-串聯質譜法，毛細管電泳法，酶聯免疫法。抗生素菌渣是發酵生產抗生素過程中的副產物，主要由發酵菌絲體、糖類、粗蛋白、少量未利用完全的無機鹽以及未提取完全的抗生素和其代謝產物組成。外觀呈豆腐渣樣，氣味因培養的菌類不同而異，含水率一般較高，堆積存放容易二次發酵產生臭味氣體。在利用微生物發酵生產林可霉素的過程中由于提取率低菌渣中殘留大量的林可霉素，而且極難降解，造成嚴重的環境污染。據有關資料統計，我國林可霉素年排放量約為數百萬噸，目前主要處理方式是占用土地堆放。林可霉素菌渣外觀呈土青色，含水率在70-85％之間，堆放處理不僅造成資源浪費，而且經雨水沖刷后還會污染土壤、地下水等生態環境。過去一直對菌渣采用干燥加工處理后作為飼料或飼料添加劑使用。但是，近期研究結果發現，菌渣中殘留的抗生素會在動物體內積累，人類食用此類動物源性食品會對身體造成危害。而且動物長期使用抗生素，會對其產生抗藥性，誘導產生耐藥細菌，破壞環境的微生態平衡。2008年中國將抗生素菌渣列入危險廢物的名單，抗生素菌渣未經無害化處理嚴禁二次利用。建立穩定、靈敏、高效的菌渣林可霉素殘留量檢測方法，為菌渣污染控制標準的制定奠定基礎。抗生素在菌絲體殘留量的檢測在國外研究比較早，主要是檢測青霉素發酵中間產物中青霉素含量。目前國內報道的檢測菌渣中林可霉素的方法是微生物培養法，此方法的靈敏度均較低，而且方法不完善，方法的準確度和精密度以及檢出限均有待考量，不能滿足現代殘留檢測分析的要求。因此，準確可靠的殘留檢測方法還有待探討。
技術實現思路
本專利技術的目的是彌補現有技術中無法快速/準確檢測林可霉素菌渣中林可霉素的缺陷，沒有一種有效解決基質效應的影響的問題，而提供一種林可霉素菌渣中林可霉素提取且測定殘留量的方法，以期為探明林可霉素菌渣中林可霉素的殘留及其轉化提供方法依據。本專利技術的一種菌渣中林可霉素殘留量的檢測方法，它是按照以下步驟進行的：一、供試品樣品制備：1)稱取含有林可霉素的菌渣，加入提取劑，渦旋振蕩1min，于超聲中輔助提取30min，以3000～4000rpm離心10min，取上清液；2)稱取PSA、C18和無水Na2SO4，渦旋混合1min后加入上一步的上清液，繼續渦旋1min，以4000rpm/min離心10min，收集上清液，得供試品溶液；二、標準曲線繪制：用甲醇將林可霉素標準貯備液稀釋成質量濃度為10.00mg/L、20.00mg/L、40.00mg/L、50mg/L、100.00mg/L、200.00mg/L和400mg/L標準工作溶液；采用高效液相色譜法對上述標準工作溶液進行檢測，以測得峰面積作為縱坐標，以標準工作溶液濃度作為橫坐標，繪制標準曲線，求回歸方程和相關系數；三、測定：吸取上述標準品工作溶液和供試品溶液注入液相色譜儀中，根據外標法計算林可霉素素殘留量；色譜條件：色譜柱：AglientExtend-C18柱，色譜柱內徑為4.6mm，柱長250mm，填料顆粒直徑為5μm，流動相：甲醇-0.05moL/L四硼酸鈉十水合物按體積比為60:40混合的溶液，檢測波長：214nm，進樣量：10μL，流速：1mL/min，柱溫：30℃。本專利技術包含以下有益效果:應用本方法進行林可霉素菌渣中林可霉素殘留的測定，操作簡便，準確度高，林可霉素含量與峰面積具有良好的線性關系，回收率、靈敏度、檢出限以及相對標準偏差等均能滿足殘留分析的要求。經實驗證明，該方法能用于各種性質差異較大的林可霉素菌渣，其回收率、靈敏度、檢出限等在各批次菌渣中都有較好的準確度和精密度。通過本專利技術的方法可以有效地從菌渣中提取林可霉素，盡最大可能降低菌渣中其他雜質對后續檢測的影響，從而提高檢測的準確度(1)本專利技術首次較完善的提出超聲輔助結合分散固相萃取法提取林可霉素菌渣中林可霉素的高效液相色譜法：第一步超聲輔助提取林可霉素菌渣中的林可霉素，第二步分散固相萃取技術應用于提取液凈化，第三步高效液相色譜-紫外檢測器用于林可霉素含量的測定，此方法簡單快速，準確可靠。(2)本專利技術靈敏度高，可滿足我國對于林可霉素在動物性組織中的最高殘留限量的檢測要求，可為林可霉素菌渣資源化利用為飼料提供一定的技術依據。本專利技術方法林可霉素在100～800mg/kg添加濃度水平上回收率為82％～115％。定性檢測限為0.027mg/kg，定量檢測限為0.089mg/kg。日內變異系數為3％～9％，小于10％；日間變異系數為7.5％～12％，小于15％。附圖說明圖1為林可霉素標準曲線；圖2為濃度100mg/L林可霉素的標準色譜圖；圖3為新鮮林可霉素菌渣中殘留林可霉素色譜圖。具體實施方式具體實施方式一：本實施方式的一種菌渣中林可霉素殘留量的檢測方法，它是按照以下步驟進行的：一、供試品樣品制備：1)稱取含有林可霉素的菌渣，加入提取劑，渦旋振蕩1min，于超聲中輔助提取30min，以3000～4000rpm離心10min，取上清液；2)稱取PSA、C18和無水Na2SO4，渦旋混合1min后加入上一步的上清液，繼續渦旋1min，以4000rpm/min離心10min，收集上清液，得供試品溶液；二、標準曲線繪制：用甲醇將林可霉素標準貯備液稀釋成質量濃度為10.00mg/L、20.00mg/L、40.00mg/L、50mg/L、100.00mg/L、200.00mg/L和400mg/L標準工作溶液；采用高效液相色譜法對上述標準工作溶液進行檢測，以測得峰面積作為縱坐標，以標準工作溶液濃度作為橫坐標，繪制標準曲線，求回歸方程和相關系數；三、測定：吸取上述標準品工作溶液和供試品溶液注入液相色譜儀中，根據外標法計算林可霉素素殘留量；色譜條件：色譜柱：AglientExtend-C18柱，色譜柱內徑為4.6mm，柱長250mm，填料顆粒直徑為5μm，流動相：甲醇-0.05moL/L四硼酸鈉十水合物按體積比為60:40混合的溶液，檢測波長：214nm，進樣量：10μL，流速：1mL/min，柱溫：30℃。具體實施方式二：本實施方式與具體實施方式一不同的是：林可霉素菌渣與提取劑的質量體積比為1g：5～15mL。其它與具體實施方式一相同。具體實施方式三：本實施方式與具體實施方式一不同的是：林可霉素菌渣與提取劑的質量體積比為1g：10mL。其它與具體實施方式一相同。具體實施方式四：本實施方式與具體實施方式一不同的是：提取劑為體積百分含量為0.1％～0.15％的氨化乙腈。其它與具體實施方式一相同。具體實施方式五：本實施方式與具體實施方式一不同的是：提取劑為體積百分含量為0.12％的氨化乙腈。其它與具體實施方式一相同。具體實施方式六：本實施方式與具體實施方式一不同的是：PSA、C18和無水Na2SO4的質量體積比為0.05～0.1g：1.0g：10mL。其它與具體實施方式一相同。具體實施方式七：本實施方式與具體實施方式一不同的是：PSA、C18和無水Na2SO4的質量體積比為0.05g：1.0g：1本文檔來自技高網...

【技術保護點】
1.一種菌渣中林可霉素殘留量的檢測方法，其特征在于它是按照以下步驟進行的：一、供試品樣品制備：1)稱取含有林可霉素的菌渣，加入提取劑，渦旋振蕩1min，于超聲中輔助提取30min，以3000～4000rpm離心10min，取上清液；2)稱取PSA、C18和無水Na2SO4，渦旋混合1min后加入上一步的上清液，繼續渦旋1min，以4000rpm/min離心10min，收集上清液，得供試品溶液；二、標準曲線繪制：用甲醇將林可霉素標準貯備液稀釋成質量濃度為10.00mg/L、20.00mg/L、40.00mg/L、50mg/L、100.00mg/L、200.00mg/L和400mg/L標準工作溶液；采用高效液相色譜法對上述標準工作溶液進行檢測，以測得峰面積作為縱坐標，以標準工作溶液濃度作為橫坐標，繪制標準曲線，求回歸方程和相關系數；三、測定：吸取上述標準品工作溶液和供試品溶液注入液相色譜儀中，根據外標法計算林可霉素素殘留量；色譜條件：色譜柱：AglientExtend?C18柱，色譜柱內徑為4.6mm，柱長250mm，填料顆粒直徑為5μm，流動相：甲醇?0.05moL/L四硼酸鈉十水合物按體積比為60:40混合的溶液，檢測波長：214nm，進樣量：10μL，流速：1mL/min，柱溫：30℃。...

【技術特征摘要】
1.一種菌渣中林可霉素殘留量的檢測方法，其特征在于它是按照以下步驟進行的：一、供試品樣品制備：1)稱取含有林可霉素的菌渣，加入提取劑，渦旋振蕩1min，于超聲中輔助提取30min，以3000～4000rpm離心10min，取上清液；2)稱取PSA、C18和無水Na2SO4，渦旋混合1min后加入上一步的上清液，繼續渦旋1min，以4000rpm/min離心10min，收集上清液，得供試品溶液；二、標準曲線繪制：用甲醇將林可霉素標準貯備液稀釋成質量濃度為10.00mg/L、20.00mg/L、40.00mg/L、50mg/L、100.00mg/L、200.00mg/L和400mg/L標準工作溶液；采用高效液相色譜法對上述標準工作溶液進行檢測，以測得峰面積作為縱坐標，以標準工作溶液濃度作為橫坐標，繪制標準曲線，求回歸方程和相關系數；三、測定：吸取上述標準品工作溶液和供試品溶液注入液相色譜儀中，根據外標法計算林可霉素素殘留量；色譜條件：色譜柱：AglientExtend-C18柱，色譜柱內徑為4.6mm，柱長250mm，填料顆粒直徑為5μm，流動相：甲醇-0.05moL/L四硼酸鈉十水合物按體積比為60:40混合的溶液，檢測波長：214nm，進樣量：10μL，流速：1mL/min，柱溫：30℃。2.根據權利要求1所述的一種菌...

【專利技術屬性】
技術研發人員：王義，張鵬，金昌福，李寧飛，
申請(專利權)人：寧夏希望田野生物農業科技有限公司，
類型：發明
國別省市：寧夏,64