血管內(nèi)皮生長因子表位蛋白疫苗的制備方法技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)提供了靶向血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）表位蛋白疫苗的制備過程和使用方法。具體地，本發(fā)明專利技術(shù)的抗原蛋白用VEGF表位替換白喉毒素DTT結(jié)構(gòu)域的291?296區(qū)，構(gòu)成新的表位蛋白。所述的抗原蛋白與氫氧化鋁佐劑聯(lián)合使用后，具有較高的免疫原性，能夠激發(fā)小鼠體內(nèi)產(chǎn)生針對人VEGF165的Th2型免疫反應(yīng)。

Preparation of epitope protein vaccine of vascular endothelial growth factor

The invention provides a preparation process and a usage method of a targeted protein vaccine targeting vascular endothelial growth factor (VEGF). Specifically, the antigen protein of the invention uses VEGF epitope to replace the 291 - 296 region of the diphtheria toxin DTT domain, forming a new epitope protein. The antigen protein, combined with aluminum hydroxide adjuvant, has high immunogenicity and can stimulate the Th2 type immune response to human VEGF165 in mice.

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
血管內(nèi)皮生長因子表位蛋白疫苗的制備方法
本專利技術(shù)屬于生物和醫(yī)藥領(lǐng)域，具體地涉及具有免疫原性的血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）疫苗及其制法和用途。本專利技術(shù)制備到的表位蛋白抗原在小鼠體內(nèi)具有較強(qiáng)的免疫原性，能夠激發(fā)小鼠體內(nèi)Th2型免疫應(yīng)答。
技術(shù)介紹
血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）是血管生成和血管通透性變化的過程中的重要因子，在腫瘤環(huán)境中其介導(dǎo)的信號對腫瘤干細(xì)胞和腫瘤的生長過程中具有關(guān)鍵的作用。大多數(shù)VEGF都是腫瘤細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞(包括巨噬細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞)分泌的，通過免疫組化和腫瘤細(xì)胞顯微分析可以觀察到這一現(xiàn)象。VEGF能直接刺激血管生成，這是一個(gè)涉及到VEGFR誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞的遷移和增殖的過程，同時(shí)增加了血管通透性，改變了細(xì)胞外基質(zhì)環(huán)境。而腫瘤細(xì)胞分泌的VEGF能夠促進(jìn)功能分化和上皮-間質(zhì)表型轉(zhuǎn)化過程，增加了腫瘤侵襲和存活率，并能促進(jìn)腫瘤干細(xì)胞的功能。VEGF能招募調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)，也能通過VEGFR2介導(dǎo)的免疫反應(yīng)抑制未成熟的樹突狀細(xì)胞(dendriticcells,DC)的功能成熟并損害的DC分化，抑制骨髓干細(xì)胞κB的激活，進(jìn)而可以抑制腫瘤環(huán)境中的免疫應(yīng)答反應(yīng)。大多數(shù)人類腫瘤可以過度表達(dá)VEGFA的mRNA，這與腫瘤細(xì)胞浸潤、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)、血管密度增加和預(yù)后性差有很大的聯(lián)系。1993年在多形性膠質(zhì)細(xì)胞瘤裸鼠模型上證實(shí)，通過VEGF抗體抑制腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生的VEGF能夠使得腫瘤血管密度下降，抑制小鼠體內(nèi)腫瘤的生長。一系列研究表明，抗VEGF治療聯(lián)合化療或放療，具有非常顯著的抗腫瘤效果。2004年FDA批準(zhǔn)重組人源化VEGF特異性單克隆抗體bevacizumab(Avastin,Genentech/Roche)作為轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌的一線用藥，2015年Avastin銷售額達(dá)到69億美元，仍然保持持續(xù)增長的態(tài)勢，而一年的費(fèi)用達(dá)到10萬美元十分昂貴。VEGF抑制劑還與眼部新生血管生長密切相關(guān)，2004年和2006年FDA分別批準(zhǔn)了VEGF抑制劑pegaptanib(Macugen;Pfizer/Valeant)和ranibizumab(Lucentis;Genentech/Novartis)作為眼部黃斑變性的治療藥物。抗VEGF藥物臨床表現(xiàn)很不錯(cuò)，VEGF抑制劑在晚期或難治的惡性腫瘤患者治療效果顯著，已經(jīng)成為治療轉(zhuǎn)移性腫瘤的一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)，靶向VEGF療法也使得眼部疾病的治療出現(xiàn)了飛速的發(fā)展。接下來的研究重點(diǎn)會(huì)在提高靶向性和選擇合適的生物標(biāo)記物進(jìn)一步提高療效上面。隨著的不斷發(fā)展創(chuàng)新，在抗血管生成治療疾病的策略中，主動(dòng)特異性免疫治療是一項(xiàng)正在緊張研究的工作，由于抗血管生成的疫苗大多設(shè)計(jì)成完整的內(nèi)皮細(xì)胞或DNA、肽段和有代表性的VEGF、VEGFR蛋白，還有一些是與血管生成有關(guān)的其他分子，下調(diào)了機(jī)體特異性免疫反應(yīng)的強(qiáng)度和持續(xù)時(shí)間，因此可以想象，相對于傳統(tǒng)藥物，急性毒性和不良反應(yīng)的事件會(huì)大大減少，而且這些疫苗可以與放療、化療還有其他抗血管生成抗體一起使用，在防止或延緩腫瘤的復(fù)發(fā)和擴(kuò)散過程中取得了突出的成果。只有極少數(shù)的靶向整個(gè)內(nèi)皮細(xì)胞和VEGFR的抗血管生成疫苗進(jìn)入到早期階段的臨床研究，并取得了較好的抑制腫瘤生長的效果。J.V.Gavilondo開發(fā)了一種新型的癌癥治療性疫苗，使用人源VEGF變異體的作為抗原，結(jié)合細(xì)菌佐劑。已經(jīng)證明在小鼠，大鼠，兔子和非人類靈長類動(dòng)物模型中是安全的，在臨床一期實(shí)驗(yàn)中，該疫苗能夠誘導(dǎo)抗VEGF抗體并靶向腫瘤細(xì)胞產(chǎn)的VEGF，具有抗腫瘤生長和轉(zhuǎn)移效果。炎癥也與血管生成緊密相關(guān)，VEGF疫苗有助于控制關(guān)節(jié)炎和滑膜炎的發(fā)展，減少炎癥的產(chǎn)生。因此開發(fā)新的針對VEGF的疫苗具有重要的意義，而這些疫苗的制備需要解決以下兩個(gè)問題：（1）VEGF疫苗具有免疫原性，可以刺激機(jī)體進(jìn)行免疫應(yīng)答，產(chǎn)生針對VEGF的抗體；（2）VEGF疫苗能特異性識(shí)別并靶向腫瘤內(nèi)皮細(xì)胞，進(jìn)而抑制腫瘤生長，促進(jìn)抗腫瘤免疫過程。白喉毒素(Diphtheriatoxin，DT)是廣泛的研究和了解的細(xì)菌毒素之一，具有一般的細(xì)胞毒性，具有抑制蛋白合成的能力，還是一個(gè)跨膜蛋白，這使得DT成為一直以來研究最火熱的毒素。白喉毒素T區(qū)202-378部分既有跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)作用又起著分子伴侶的作用，具有大量的T輔助表位，本課題以DTT蛋白分子為骨架，促進(jìn)產(chǎn)生免疫應(yīng)答反應(yīng)。鋁佐劑是目前FDA批準(zhǔn)的唯一疫苗佐劑，可以誘導(dǎo)Th2型免疫反應(yīng)產(chǎn)生抗體，不誘導(dǎo)細(xì)胞毒性T細(xì)胞和細(xì)胞免疫，還可以通過直接或間接刺激樹突狀細(xì)胞，激活補(bǔ)體和誘導(dǎo)趨化因子的釋放，進(jìn)一步提高免疫應(yīng)答。因此，本專利技術(shù)以白喉毒素DTT結(jié)構(gòu)域?yàn)檩d體蛋白，將VEGF表位替換其291-296氨基酸表位構(gòu)成新的VEGF表位蛋白疫苗，與鋁佐劑相結(jié)合，在小鼠模型上檢測疫苗的免疫原性。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
本專利技術(shù)的一個(gè)目的是提供一種韓座機(jī)的VEGF表位蛋白疫苗，包括VEGF表位、白喉毒素和液體佐劑。具體的，VEGF表位插入由白喉毒素T結(jié)構(gòu)域291-296區(qū)組成的載體蛋白，液體佐劑是氫氧化鋁佐劑。本專利技術(shù)的另一個(gè)目的是提供生產(chǎn)含佐劑的VEGF表位蛋白疫苗的制備方法，步驟包括設(shè)計(jì)含有VEGF表位基因的引物，將目的基因克隆到DTT骨架上，構(gòu)建表位蛋白疫苗表達(dá)載體，純化得到VEGF表位蛋白，最后添加液體佐劑。本專利技術(shù)還有一個(gè)目的是提供增強(qiáng)VEGF表位蛋白疫苗免疫原性的方法，包括步驟：（1）使用白喉毒素T結(jié)構(gòu)域作為載體蛋白，既有跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)作用又起著分子伴侶的作用，具有大量的T輔助表位，促進(jìn)產(chǎn)生免疫應(yīng)答反應(yīng)；（2）引入氫氧化鋁佐劑，誘導(dǎo)Th2型免疫反應(yīng)產(chǎn)生抗體，安全可靠。本專利技術(shù)還提供這種含佐劑的VEGF表位蛋白疫苗的用途。相比現(xiàn)在正在研制使用的VEGF單抗及疫苗，本專利技術(shù)將人VEGF表位插入白喉毒素T結(jié)構(gòu)域，構(gòu)建新的表位蛋白疫苗，最后添加安全可靠的氫氧化鋁佐劑。該疫苗打破了小鼠機(jī)體免疫耐受，刺激機(jī)體產(chǎn)生針對Human-VEGF165的抗體，抗體滴度較高，能在體內(nèi)存在較長時(shí)間，主要進(jìn)行Th2型免疫應(yīng)答，激活B細(xì)胞進(jìn)行免疫反應(yīng)，具有良好的免疫原性。該疫苗為腫瘤、眼部疾病和炎癥等血管相關(guān)疾病的治療和預(yù)防提供了一種新的方法。應(yīng)理解，在本專利技術(shù)范圍內(nèi)中，本專利技術(shù)的上述各技術(shù)特征和在下文（如實(shí)施例）中具體描述的各技術(shù)特征之間都可以互相組合，從而構(gòu)成新的或優(yōu)選的技術(shù)方案。附圖說明圖1為抗血清anti-VEGF抗體檢測結(jié)果，與PBS和DTT組相比，實(shí)驗(yàn)組具有顯著性差異，p<0.0001，說明VEGF表位蛋白疫苗能夠打破小鼠體內(nèi)免疫耐受，產(chǎn)生針對VEGF的抗體。圖2為抗體維持時(shí)間檢測結(jié)果，相比于免疫一周后，一月后的抗體檢測滴度為前者的80%左右，說明在小鼠體內(nèi)抗體量慢慢減少，仍可以維持一段時(shí)間；圖3為抗體亞型檢測結(jié)果，IgG1/IgG2a遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于1，小鼠體內(nèi)主要進(jìn)行Th2型免疫應(yīng)答，激活B細(xì)胞進(jìn)行免疫反應(yīng)。具體實(shí)施方式本專利技術(shù)經(jīng)過廣泛而深入的研究，發(fā)現(xiàn)將人VEGF表位插入白喉毒素T結(jié)構(gòu)域后，具有VEGF的免疫原性，可以打破小鼠體內(nèi)免疫耐受，產(chǎn)生針對人VEGF165的抗體，并進(jìn)行Th2型免疫途徑。在此基礎(chǔ)上完成了本專利技術(shù)。代表性蛋白血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）血管內(nèi)皮生長因子（vascularendothelialgrowthfactor）人VEG本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
1.一種含佐劑的VEGF表位蛋白疫苗，其特征在于，包括人VEGF表位、載體蛋白和佐劑。

【技術(shù)特征摘要】
1.一種含佐劑的VEGF表位蛋白疫苗，其特征在于，包括人VEGF表位、載體蛋白和佐劑。2.按照權(quán)利要求1所述的VEGF表位蛋白疫苗，其特征在于：載體蛋白為破傷風(fēng)毒素T結(jié)構(gòu)域。3.按照權(quán)利要求1或2所述的VEGF表位蛋白疫苗，其特征在于：佐劑為氫氧化鋁。4.按照權(quán)利要求1所述的VEGF表位蛋白疫苗，其特征在于：既可單獨(dú)使用也可與載體組合支撐藥物組合物。5.按照權(quán)利要求1所述的VEGF表位蛋白疫...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：張康，蔡花漫，葉龍，張麗，周福強(qiáng)，徐愛章，鄧立，李榮秀，
申請(專利權(quán))人：上海亨臻實(shí)業(yè)有限公司，
類型：發(fā)明
國別省市：上海,31