結(jié)合癌細胞的DNA適配體制造技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)的目的在于提供一種針對癌細胞的適配體，其與現(xiàn)有適配體比具有更高的結(jié)合能力、特異性和/或穩(wěn)定性。本發(fā)明專利技術(shù)通過結(jié)合癌細胞并含有人工堿基的DNA適配體來解決上述問題。

DNA aptamers combined with cancer cells

The object of the present invention is to provide an adapter for cancer cells, which has higher binding capacity, specificity and/or stability than existing adapters. The invention solves the above problems by combining cancer cells and DNA aptamers containing artificial bases.

【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】
【國外來華專利技術(shù)】結(jié)合癌細胞的DNA適配體
本專利技術(shù)涉及結(jié)合癌細胞并含有人工堿基的DNA適配體、含有該DNA適配體的藥物組合物以及使用該DNA適配體檢測癌細胞的方法等。
技術(shù)介紹
具有針對靶標(biāo)分子的結(jié)合活性的核酸片段稱為核酸適配體，其被期待著能作為核酸藥物而廣泛地應(yīng)用到醫(yī)療中。近年來，揭示了不僅是低分子物質(zhì)和蛋白質(zhì)，而且細胞和病毒本身也能成為核酸適配體的靶標(biāo)(非專利文獻1～3)。通過將全細胞作為靶標(biāo)，可以獲得識別在細胞表面表達的受體和糖鏈等表征該細胞的表面分子的適配體。另外，近年來，在癌癥治療方面，以腫瘤標(biāo)志物的表達狀態(tài)為指標(biāo)來確定治療策略變得日益普遍。但是，已知的標(biāo)志物的種類目前仍然很少。如果通過獲得以癌細胞為靶標(biāo)的核酸適配體能發(fā)現(xiàn)可以表征多種癌的新標(biāo)志物的話，則對各種癌癥的早期診斷有幫助。此外，如果能獲得與癌細胞特異性靶標(biāo)結(jié)合的核酸適配體，則也可以應(yīng)用于抗癌藥物和給藥系統(tǒng)(DDS)。但是，目前的核酸適配體在用于以治療和診斷為代表的醫(yī)療領(lǐng)域方面，在結(jié)合能力、特異性以及穩(wěn)定性等方面還有所欠缺?，F(xiàn)有技術(shù)文獻非專利文獻非專利文獻1：Sefah,K.etal.,Natureprotocols2010,5,6,pp.1169-1185非專利文獻2：Acquah,C.etal.,CriticalReviewsinBiotechnology2015,earlyOnline(Doi:10.3109/07388551.2015.1083940)非專利文獻3：Meyer,M.etal.,Appl.Microbiol.Biotechnol.2013,97,pp.7097-7109.專利技術(shù)內(nèi)容專利技術(shù)所要解決的問題因此，需要開發(fā)一種針對癌細胞的適配體，其與現(xiàn)有的核酸適配體相比具有更高的結(jié)合能力、特異性和/或穩(wěn)定性解決問題的技術(shù)方案本專利技術(shù)人分別以來源于乳腺癌的三種細胞株(MCF7、MDA-MB-231、T-47D)為靶標(biāo)，實施使用含有本專利技術(shù)人開發(fā)的人工堿基的文庫的Cell-SELEX方法(WO2013/073602)，得到了含有人工堿基的多個DNA適配體。每個含有人工堿基的DNA適配體雖然與作為靶標(biāo)的細胞株緊密結(jié)合，但基本沒有確認到與非癌細胞的親和性。此外，對得到的DNA適配體進行了進一步研究，結(jié)果確認到結(jié)合絕大多數(shù)癌細胞的DNA適配體，以及結(jié)合能力因細胞株而異的DNA適配體。前者的DNA適配體在可以檢測到廣泛的癌細胞方面具有較高實用性，后者的DNA適配體在可以用于癌細胞分類方面具有較高實用性。本專利技術(shù)基于上述見解而完成的，包括以下方案。(1)一種結(jié)合癌細胞的DNA適配體，其含有以下(i)或(ii)的核苷酸序列：(i)(a)N1N2N3N4N5AGGGGTGTTTGTGCCGTGAGN26TGTN30N31N32N33N34(即SEQIDNO:35)所示的核苷酸序列，該序列中，N1～N5獨立地為G、T、A或C，N26為7-(2-噻吩基)-3H-咪唑并[4,5-b]吡啶-3-基，N30與N5形成堿基對，N31與N4形成堿基對，N32與N3形成堿基對，N33與N2形成堿基對，N34與N1形成堿基對；或者(b)在(i)(a)所示的核苷酸序列中除N26以外的位置添加、缺失和/或置換一個或數(shù)個(1又は數(shù)個)核苷酸而成的核苷酸序列；以及(ii)(a)N1N2N3N4N5N6GATCACN13N14CTAGGGGN22CCN25N26N27N28N29N30N31(即SEQIDNO:28)所示的核苷酸序列，該序列中，N1～N6、N14、N25獨立地為G、T、A或C，N13和N22為7-(2-噻吩基)-3H-咪唑并[4,5-b]吡啶-3-基，N26與N4形成堿基對，N29與N3形成堿基對，N30與N2形成堿基對，N31與N1形成堿基對，N27和N28獨立地為G、T、A、C或不存在；或者(b)在(ii)(a)所示的核苷酸序列中除N13和N22以外的位置添加、缺失和/或置換一個或數(shù)個核苷酸而成的核苷酸序列。(2)根據(jù)(1)所述的DNA適配體，其中，(i)(a)或(ii)(a)的核苷酸序列在末端還含有1～5個GC堿基對。(3)根據(jù)(1)或(2)所述的DNA適配體，其中，所述堿基對為GC堿基對。(4)根據(jù)(1)～(3)中任一項所述的DNA適配體，其中，(i)(b)的添加、缺失和/或置換是在SEQIDNO:35的第1位～第5位或第30位～第34位進行的。(5)根據(jù)(1)～(3)中任一項所述的DNA適配體，其中，(ii)(b)的添加、缺失和/或置換是在SEQIDNO:28的第1位～第6位、第14位或第25位～第31位進行的。(6)根據(jù)(1)或(2)所述的DNA適配體，其中，(i)(a)的核苷酸序列是SEQIDNO:36、SEQIDNO:37或SEQIDNO:40所示的序列。(7)根據(jù)(1)或(2)所述的DNA適配體，其中，(ii)(a)的核苷酸序列是SEQIDNO:29所示的序列。(8)根據(jù)(1)～(7)中任一項所述的DNA適配體，其在3’末端還含有小發(fā)夾結(jié)構(gòu)，所述小發(fā)夾結(jié)構(gòu)由從5’末端向3’末端依次連接的下述(A)～(C)的核酸區(qū)域組成：(A)由2～5個任意核苷酸組成的第一核酸區(qū)域；(B)由GNA或GNNA的核苷酸序列組成的第二核酸區(qū)域，其中，各個N獨立地為G、T、A或C中的任一個；以及(C)由與第一核酸區(qū)域互補的核苷酸序列組成的第三核酸區(qū)域，并且，所述小發(fā)夾結(jié)構(gòu)由莖部和環(huán)部構(gòu)成，其中，所述莖部是第一核酸區(qū)域和第三核酸區(qū)域相互堿基配對而成的，所述環(huán)部由第二核酸區(qū)域組成。(9)一種結(jié)合乳腺癌細胞的DNA適配體，其含有以下(I)～(IV)中任一個核苷酸序列：(I)(a)N1N2N3N4N5N6CAGCCTGGGN16TN18TCTTTN24AGTCN29AN31TTCAN36TCGN40N41N42N43N44N45(即SEQIDNO:43)所示的核苷酸序列，該序列中，N1～N6、N18、N24、N31和N36獨立地為G、T、A或C，N16為7-(2-噻吩基)-3H-咪唑并[4,5-b]吡啶-3-基，N29為7-(2-噻吩基)-3H-咪唑并[4,5-b]吡啶-3-基、G、T、A或C，N40與N6形成堿基對，N41與N5形成堿基對，N42與N4形成堿基對，N43與N3形成堿基對，N44與N2形成堿基對，N45與N1形成堿基對；或者(b)在(I)(a)所示的核苷酸序列中除N16以外的位置添加、缺失和/或置換一個或數(shù)個核苷酸而成的核苷酸序列；以及(II)(a)N1N2N3N4CN6N7TCGAACTGN16N17ATGAGN23GTN26N27N28N29N30N31(即SEQIDNO:2)所示的核苷酸序列，該序列中，N1～N4、N7、N16、N23、N26和N31獨立地為G、T、A或C，N6為7-(2-噻吩基)-3H-咪唑并[4,5-b]吡啶-3-基、G、T、A或C，N17為7-(2-噻吩基)-3H-咪唑并[4,5-b]吡啶-3-基，N27與N3形成堿基對，N28與N2形成堿基對，N29和N30為G、T、A、C或不存在；或者(b)在(II)(a)所示的核苷酸序列中除N17以外的位置添加、缺失和/或置換一個或數(shù)個核苷酸而成的核苷酸序列；(III)(a)N1N2N3CCG本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護點】
1.一種結(jié)合癌細胞的DNA適配體，其含有以下(i)或(ii)的核苷酸序列：(i)(a)N1N2N3N4N5AGGGGTGTTTGTGCCGTGAGN26TGTN30N31N32N33N34即SEQ?ID?NO:35所示的核苷酸序列，該序列中，N1～N5獨立地為G、T、A或C，N26為7?(2?噻吩基)?3H?咪唑并[4,5?b]吡啶?3?基，N30與N5形成堿基對，N31與N4形成堿基對，N32與N3形成堿基對，N33與N2形成堿基對，N34與N1形成堿基對；或者(b)在(i)(a)所示的核苷酸序列中除N26以外的位置添加、缺失和/或置換一個或數(shù)個核苷酸而成的核苷酸序列；以及(ii)(a)N1N2N3N4N5N6GATCACN13N14CTAGGGGN22CCN25N26N27N28N29N30N31即SEQ?ID?NO:28所示的核苷酸序列，該序列中，N1～N6、N14、N25獨立地為G、T、A或C，N13和N22為7?(2?噻吩基)?3H?咪唑并[4,5?b]吡啶?3?基，N26與N4形成堿基對，N29與N3形成堿基對，N30與N2形成堿基對，N31與N1形成堿基對，N27和N28獨立地為G、T、A、C或不存在；或者(b)在(ii)(a)所示的核苷酸序列中除N13和N22以外的位置添加、缺失和/或置換一個或數(shù)個核苷酸而成的核苷酸序列。...

【技術(shù)特征摘要】
【國外來華專利技術(shù)】2015.10.30 JP 2015-2145911.一種結(jié)合癌細胞的DNA適配體，其含有以下(i)或(ii)的核苷酸序列：(i)(a)N1N2N3N4N5AGGGGTGTTTGTGCCGTGAGN26TGTN30N31N32N33N34即SEQIDNO:35所示的核苷酸序列，該序列中，N1～N5獨立地為G、T、A或C，N26為7-(2-噻吩基)-3H-咪唑并[4,5-b]吡啶-3-基，N30與N5形成堿基對，N31與N4形成堿基對，N32與N3形成堿基對，N33與N2形成堿基對，N34與N1形成堿基對；或者(b)在(i)(a)所示的核苷酸序列中除N26以外的位置添加、缺失和/或置換一個或數(shù)個核苷酸而成的核苷酸序列；以及(ii)(a)N1N2N3N4N5N6GATCACN13N14CTAGGGGN22CCN25N26N27N28N29N30N31即SEQIDNO:28所示的核苷酸序列，該序列中，N1～N6、N14、N25獨立地為G、T、A或C，N13和N22為7-(2-噻吩基)-3H-咪唑并[4,5-b]吡啶-3-基，N26與N4形成堿基對，N29與N3形成堿基對，N30與N2形成堿基對，N31與N1形成堿基對，N27和N28獨立地為G、T、A、C或不存在；或者(b)在(ii)(a)所示的核苷酸序列中除N13和N22以外的位置添加、缺失和/或置換一個或數(shù)個核苷酸而成的核苷酸序列。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的DNA適配體，其中，(i)(a)或(ii)(a)的核苷酸序列在末端還含有1～5個GC堿基對。3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的DNA適配體，其中，所述堿基對為GC堿基對。4.根據(jù)權(quán)利要求1～3中任一項所述的DNA適配體，其中，(i)(b)的添加、缺失和/或置換是在SEQIDNO:35的第1位～第5位或第30位～第34位進行的。5.根據(jù)權(quán)利要求1～3中任一項所述的DNA適配體，其中，(ii)(b)的添加、缺失和/或置換是在SEQIDNO:28的第1位～第6位、第14位或第25位～第31位進行的。6.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的DNA適配體，其中，(i)(a)的核苷酸序列是SEQIDNO:36、SEQIDNO:37或SEQIDNO:40所示的序列。7.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的DNA適配體，其中，(ii)(a)的核苷酸序列是SEQIDNO:29所示的序列。8.根據(jù)權(quán)利要求1～7中任一項所述的DNA適配體，其在3’末端還含有小發(fā)夾結(jié)構(gòu)，所述小發(fā)夾結(jié)構(gòu)由從5’末端向3’末端依次連接的下述(A)～(C)的核酸區(qū)域組成：(A)由2～5個任意核苷酸組成的第一核酸區(qū)域；(B)由GNA或GNNA的核苷酸序列組成的第二核酸區(qū)域，其中，各個n獨立地為G、T、A或C中的任一個；以及(C)由與第一核酸區(qū)域互補的核苷酸序列組成的第三核酸區(qū)域，并且，所述小發(fā)夾結(jié)構(gòu)由莖部和環(huán)部構(gòu)成，其中，所述莖部是第一核酸區(qū)域和第三核酸區(qū)域相互堿基配對而成的，所述環(huán)部由第二核酸區(qū)域組成。9.一種結(jié)合乳腺癌細胞的DNA適配體，其含有以下(I)～(IV)中任一個核苷酸序列：(I)(a)N1N2N3N4N5N6CAGCCTGGGN16TN18TCTTTN24AGTCN29AN31TTCAN36TCGN40N41N42N43N44N45即SEQIDNO:43所示的核苷酸序列，該序列中，N1～N6、N18、N24、N31和N36獨立地為G、T、A或C，N16為7-(2-噻吩基)-3H-咪唑并[4,5-b]吡啶-3-基，N29為7-(2-噻吩基)-3H-咪唑并[4,5-b]吡啶-3-基、G、T、A或C，N40與N6形成堿基對，N41與N5形成堿基對，N42與N4形成堿基對，N43與N3形成堿基對，N44與N2形成堿基對，N45與N1形成堿基對；或者(b)在(I)(a)所示的核苷酸序列中除N16以外的位置添加、缺失和/或置換一個或數(shù)個核苷酸而成的核苷酸序列；以及(II)(a)N1N2N3N4CN6N7TCGAACTGN16N17ATGAGN23GTN26N27N28N29N30N31即SEQIDNO:2所示的核苷酸序列，該序列中，N1～N4、N7、N16、N23、N26和N31獨立地為G、T、A或C，N6為7-(2-噻吩基)-3H-咪唑并[4,5-b]吡啶-3-基、G、T、A或C，N17為7-(2-噻吩基)-3H-咪唑并[4,5-b]吡啶-3-基，N27與N3形成堿基對，N28與N2形成堿基對，N29和N30為G、T、A、C或不存在；或者(b)在(II)(a)所示的核苷酸序列中除N17以外的位置添加、缺失和/或置換一個或數(shù)個核苷酸而成的核苷酸序列；(III)(a)N1N2N3CCGGCTN10N11N12N13N14N15N16N17N18N19N20N21N22N23N24N25TCCTGGN32N33TAAGGTTTCTAAN46N47N48N49N50N51即SEQIDNO:18所示的核苷酸序列，該序列中，N1～N3、N13～N17、N19～N22、N33、N46～N48和N50獨立地為G、T、A或C，N10～N12和N23～N25為G、T、A、C或不存在，N18為7-(2-噻吩基)-3H-咪唑并[4,5-b]吡啶-3-基、G、T、A或C、或者不存在，N32為7-(2-噻吩基)-3H-咪唑并[4,5-b]吡啶-3-基，N49與N3形成堿基對，N51與N1形成堿基對，N10～N15中的三個以上與N...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：二見和伸，平尾一郎，平尾路子，
申請(專利權(quán))人：塔古西庫斯生物株式會社，
類型：發(fā)明
國別省市：日本,JP