一種抗菌融合肽及其制備方法和應(yīng)用技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)公開了一種提供了一種抗菌融合肽，其肽鏈序列為：SISLLYGRKKRRQRRR。本發(fā)明專利技術(shù)還提供了另一種抗菌融合肽，其肽鏈序列為：YGRKKRRQRRRSISLL。本發(fā)明專利技術(shù)提供了上述抗菌融合肽的制備方法，根據(jù)目標(biāo)抗菌融合肽的序列，從碳端到氮端將相應(yīng)的氨基酸進(jìn)行偶合；氮端氨基酸偶合完成后，脫保護(hù)基團(tuán)洗滌吹干；切割后抽濾，使用冰乙醚充分洗滌和離心棄去上清液三次以上；干燥后的固體粉末用去離子水溶解后，分離純化，收集主峰流出液，冷凍干燥后得目標(biāo)抗菌融合肽。本發(fā)明專利技術(shù)還公開了抗菌融合肽在藥品中的應(yīng)用。本發(fā)明專利技術(shù)在抗癌肽的基礎(chǔ)上得到了具有抗菌效果的融合肽，且抗菌融合肽的抗菌效果接近了強(qiáng)力抗菌藥卡那霉素的抗菌作用，為進(jìn)一步具體研發(fā)具有抗癌抗菌雙重作用的藥物提供了基礎(chǔ)。

Antibacterial fusion peptide, preparation method and application thereof

The invention discloses an antibacterial fusion peptide, and its polypeptide chain sequence is SISLLYGRKKRRQRRR. The invention also provides another antibacterial fusion peptide with a sequence of YGRKKRRQRRRSISLL. The preparation method of the antimicrobial fusion peptide is provided, according to the sequence of the target antimicrobial fusion peptide, the corresponding amino acids are coupled from the carbon end to the nitrogen end; after the coupling of the amino acids at the nitrogen end is completed, the unprotected group is washed and dried; after cutting, the supernatant is sufficiently washed and centrifuged with ice ether to remove more than three times; The dried solid powders were dissolved in deionized water, separated and purified, and the effluent from the main peak was collected. After freeze-drying, the target antimicrobial fusion peptide was obtained. The invention also discloses the application of the antibacterial fusion peptide in the medicine. The antimicrobial effect of the antimicrobial fusion peptide is similar to that of Kanamycin, a strong antimicrobial drug, which provides a basis for further research and development of antitumor and antimicrobial drugs.

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
一種抗菌融合肽及其制備方法和應(yīng)用
本專利技術(shù)涉及抗菌藥
，尤其涉及一種抗菌融合肽。
技術(shù)介紹
現(xiàn)有的抗菌肽的來源有三種，天然物中提取、化學(xué)方法合成和生物方法合成。關(guān)于化學(xué)方法合成：氨基酸是兩性物質(zhì)，分子中一般含有氨基(-NH2)和羧基(-COOH)，是抗菌肽化學(xué)合成的基本原料。研究者通常將不參加縮合反應(yīng)的氨基(-NH2)、羧基(-COOH)以及帶有活潑基團(tuán)的側(cè)鏈保護(hù)起來，待到所有氨基酸都按照抗菌肽序列偶合完成之后，再進(jìn)行脫保護(hù)反應(yīng)。癌癥是由于機(jī)體異常細(xì)胞的過度繁殖增生，從而損害健康、危及生命的疾病。抗癌藥物具有抑制癌細(xì)胞增長的作用，但抗癌藥物通常不能夠抑制細(xì)菌增長，即不具備抗菌活性。癌癥患者通常身體比正常人虛弱，更容易受到細(xì)菌感染。目前的醫(yī)療實(shí)踐當(dāng)中，對于受到細(xì)菌感染的癌癥患者（或者有受到細(xì)菌感染可能的患者），在使用抗癌藥物的同時，需要另外使用抗菌藥物。藥物的增多對于患者的健康具有負(fù)面的影響，如果能夠研發(fā)出具有抗菌作用的抗癌藥，則有望減少患者的用藥量，減少用藥對于患者健康的負(fù)面影響。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
本專利技術(shù)的目的在于提供一種基于乳腺癌抑制肽BRCA1(782-786，SISLL)的抗菌融合肽。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本專利技術(shù)的抗菌融合肽為TAT（47-57）氮端連接BRCA1(782-786)的SISLL-TAT，其肽鏈序列為：SISLLYGRKKRRQRRR。本專利技術(shù)的目的還在于提供另一種基于乳腺癌抑制肽的抗菌融合肽。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本專利技術(shù)的抗菌融合肽的肽序?yàn)門AT（47-57）碳端連接BRCA1(782-786)的TAT–SISLL，其肽鏈序列為：YGRKKRRQRRRSISLL。本專利技術(shù)的目的還在于提供一種上述抗菌融合肽的制備方法，依次按以下步驟進(jìn)行：以Wang樹脂為載體，F(xiàn)moc為氨基酸側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)，哌啶的DMF溶液為脫保護(hù)試劑，HBTU、HOBT和DIEA為氨基酸縮合劑，根據(jù)目標(biāo)抗菌融合肽的序列，從碳（C-）端到氮（N-）端將相應(yīng)的氨基酸進(jìn)行偶合；直到氮端氨基酸偶合完成后，脫除氮端氨基酸的Fmoc保護(hù)基團(tuán)，洗滌后吹干；然后加入由三氟乙酸、苯甲硫醚、乙二硫醇、水和苯酚配制而成的切割試劑，切割后抽濾，將濾液收集至冰乙醚中，-20℃下靜置20小時，使沉淀物完全生成；離心棄去上清液；對沉淀物使用冰乙醚充分洗滌和離心棄去上清液三次以上；剩下的沉淀物經(jīng)干燥，所得固體粉末進(jìn)一步用去離子水溶解后，通過反相高效液相色譜（即RP-HPLC）分離純化，收集主峰流出液，并冷凍干燥后獲得相應(yīng)的目標(biāo)抗菌融合肽。所述反相高效液相色譜對抗菌融合肽的分離純化的條件如下：抗菌融合肽SISLL-TAT：色譜柱AgilentZorbax300SB-C18，色譜柱直徑9.4mm，長250mm，填料粒徑5μm，色譜柱的溫度25℃；檢測波長220nm；流速1.0mL·min-1；流動相A相：0.1%TFA（三氟乙酸）的H2O；流動相B相：0.1%TFA的CH3CN（乙腈）；流動相梯度：10%~30%B相/0~20min（從0至20分鐘流動相B的含量由10%增至30%）；收集保留時間為12.323min的流出液，冷凍干燥后得到白色粉末狀的SISLL-TAT，產(chǎn)率76%。抗菌融合肽TAT-SISLL：色譜柱AgilentZorbax300SB-C18，色譜柱直徑9.4mm，長250mm，填料粒徑5μm，色譜柱的溫度25℃；檢測波長220nm；流速1.0mL·min-1；流動相A相：0.1%TFA（三氟乙酸）的H2O；流動相B相：0.1%TFA的CH3CN（乙腈）；流動相梯度：10%~30%B相/0~20min（從0至20分鐘流動相B的含量由10%增至30%）；收集保留時間為12.223min的流出液，冷凍干燥后得到白色粉末狀的TAT-SISLL，產(chǎn)率73%。上述抗菌融合肽在藥品中的應(yīng)用。本專利技術(shù)具有如下的優(yōu)點(diǎn)：將抗癌肽與細(xì)胞穿膜肽融合在一起，能夠使抗癌肽能夠更容易進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部，從而提升抗癌肽的抗癌效果。但正常情況下，這種融合作用并不能使抗菌融合肽產(chǎn)生抗菌作用。本專利技術(shù)在抗癌肽的基礎(chǔ)上得到了具有抗菌效果的融合肽，且抗菌融合肽的抗菌效果則接近了強(qiáng)力抗菌藥卡那霉素的抗菌作用，為進(jìn)一步具體研發(fā)具有抗癌抗菌雙重作用的藥物提供了基礎(chǔ)，有利于減少癌癥患者的用藥量。附圖說明圖1是SISLL-TAT的1HNMR(D2O,400MHz)譜圖；圖2是SISLL-TAT的13CNMR(D2O,100MHz)譜圖；圖3是SISLL-TAT的ESI-MS(CH3OH)圖；圖4是TAT-SISLL的1HNMR(D2O,400MHz)譜圖；圖5是TAT-SISLL的13CNMR(D2O,100MHz)譜圖；圖6是TAT-SISLL的ESI-MS(CH3OH)圖。具體實(shí)施方式實(shí)施例一如圖1至圖3所示，本專利技術(shù)提供了一種抗菌融合肽，為TAT（47-57）氮端連接BRCA1(782-786)的SISLL-TAT，其肽鏈序列為：SISLLYGRKKRRQRRR。實(shí)施例二如圖4至圖6所示，本專利技術(shù)提供了一種抗菌融合肽，抗菌融合肽的肽序?yàn)門AT（47-57）碳端連接BRCA1(782-786)的TAT–SISLL，其肽鏈序列為：YGRKKRRQRRRSISLL。本專利技術(shù)還提供了實(shí)施例一和實(shí)施例二中抗菌融合肽的制備方法，該方法是：以Wang樹脂為載體，F(xiàn)moc為氨基酸側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)，哌啶的DMF溶液為脫保護(hù)試劑，HBTU、HOBT和DIEA為氨基酸縮合劑，根據(jù)目標(biāo)抗菌融合肽的序列，從碳（C-）端到氮（N-）端將相應(yīng)的氨基酸進(jìn)行偶合；直到氮端氨基酸偶合完成后，脫除氮端氨基酸的Fmoc保護(hù)基團(tuán)，洗滌后吹干；然后加入由三氟乙酸、苯甲硫醚、乙二硫醇、水和苯酚配制而成的切割試劑，切割后抽濾，將濾液收集至冰乙醚中，-20℃下靜置20小時，使沉淀物完全生成；離心棄去上清液；對沉淀物使用冰乙醚充分洗滌和離心棄去上清液三次以上；剩下的沉淀物經(jīng)干燥，所得固體粉末進(jìn)一步用去離子水溶解后，通過反相高效液相色譜（即RP-HPLC）分離純化，收集主峰流出液，并冷凍干燥后獲得相應(yīng)的目標(biāo)抗菌融合肽。其中，反相高效液相色譜對抗菌融合肽的分離純化的條件如下：抗菌融合肽SISLL-TAT的分離純化條件：色譜柱AgilentZorbax300SB-C18，色譜柱直徑9.4mm，長250mm，填料粒徑5μm，色譜柱的溫度25℃；檢測波長220nm；流速1.0mL·min-1；流動相A相：0.1%TFA（三氟乙酸）的H2O；流動相B相：0.1%TFA的CH3CN（乙腈）；流動相梯度：10%~30%B相/0~20min（從0至20分鐘流動相B的含量由10%增至30%）；收集保留時間為12.323min的流出液，冷凍干燥后得到白色粉末狀的SISLL-TAT，產(chǎn)率76%；抗菌融合肽TAT-SISLL的分離純化條件：色譜柱AgilentZorbax300SB-C18，色譜柱直徑9.4mm，長250mm，填料粒徑5μm，色譜柱的溫度25℃；檢測波長220nm；流速1.0mL·min-1；流動相A相：0.1%TFA（三氟乙酸）的H2O；流動相B相：0.1%TFA的CH3CN（乙腈）；流動相梯度：10%~30%B相/0~20min（從0至20分鐘流動相B的含本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
1.一種抗菌融合肽，其特征在于：抗菌融合肽為TAT（47?57）氮端連接BRCA1(782?786)的SISLL?TAT，其肽鏈序列為序列表中的序列3所示的SISLLYGRKKRRQRRR。

【技術(shù)特征摘要】
1.一種抗菌融合肽，其特征在于：抗菌融合肽為TAT（47-57）氮端連接BRCA1(782-786)的SISLL-TAT，其肽鏈序列為序列表中的序列3所示的SISLLYGRKKRRQRRR。2.一種抗菌融合肽，其特征在于：抗菌融合肽的肽序?yàn)門AT（47-57）碳端連接BRCA1(782-786)的TAT–SISLL，其肽鏈序列為序列表中的序列4所示的YGRKKRRQRRRSISLL。3.權(quán)利要求1或2中的抗菌融合肽的制備方法，其特征在于：以Wang樹脂為載體，F(xiàn)moc為氨基酸側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)，哌啶的DMF溶液為脫保護(hù)試劑，HBTU、HOBT和DIEA為氨基酸縮合劑，根據(jù)目標(biāo)抗菌融合肽的序列，從碳端到氮端將相應(yīng)的氨基酸進(jìn)行偶合；直到氮端氨基酸偶合完成后，脫除氮端氨基酸的Fmoc保護(hù)基團(tuán)，洗滌后吹干；然后加入由三氟乙酸、苯甲硫醚、乙二硫醇、水和苯酚配制而成的切割試劑，切割后抽濾，將濾液收集至冰乙醚中，-20℃下靜置20小時，使沉淀物完全生成；離心棄去上清液；對沉淀物使用冰乙醚充分洗滌和離心棄去上清液三次以上；剩下的沉淀物經(jīng)干燥，所得固體粉末進(jìn)一步用去離子水溶解后，通過反相高效液相色譜分離純化，收集主峰流出液，并冷凍干燥后獲得相應(yīng)的目標(biāo)...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：呂名秀，盧奎，買文鵬，劉廣斌，王夢偉，彭露，
申請(專利權(quán))人：河南工程學(xué)院，
類型：發(fā)明
國別省市：河南,41