一種促血小板生成素的融合蛋白及其制備方法和應(yīng)用技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)屬于基因工程制藥領(lǐng)域，涉及一種促血小板生成素的融合蛋白及其制備方法和應(yīng)用，具體涉及一種酵母偏好密碼子編碼的促血小板生成素模擬肽(Thrombopoietin?Mimetic?Peptide，TMP)二聯(lián)體與人血清白蛋白分子(Human?serum?Albumin，HSA)的融合蛋白及其制備方法和應(yīng)用。所述融合蛋包含一個HSA分子和一個酵母偏好密碼子編碼的TMP二聯(lián)體，其中，HSA分子位于融合蛋白的N?末端，酵母偏好密碼子編碼的TMP二聯(lián)體位于融合蛋白的C?末端。所述融合蛋白能在酵母體內(nèi)高水平的穩(wěn)定表達(dá)，可應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)；同時，該融合蛋白具有顯著促進(jìn)血小板生成的特性，在人體內(nèi)具有較長的半衰期，可用于制備治療多種原發(fā)性或繼發(fā)性血小板減少癥等疾病的藥物。

A thrombopoietin fusion protein and its preparation method and Application

The invention belongs to the field of genetic engineering pharmacy, and relates to a fusion protein of thrombopoietin, a preparation method and application thereof, in particular to a thrombopoietin mimetic peptide (TMP) dimer encoded by yeast preference codon and a human serum albumin molecule. HSA) fusion protein and its preparation method and application. The fusion egg comprises a HSA molecule and a TMP dimer encoded by yeast preferred codon, wherein the HSA molecule is located at the N_terminal of the fusion protein, and the TMP dimer encoded by yeast preferred codon is located at the C_terminal of the fusion protein. The fusion protein can be stably expressed in yeast at a high level and can be used for industrial production; meanwhile, the fusion protein has the characteristics of promoting platelet production and has a long half-life in human body, and can be used for preparing drugs for treating various diseases such as primary or secondary thrombocytopenia.

【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】
一種促血小板生成素的融合蛋白及其制備方法和應(yīng)用
本專利技術(shù)屬于基因工程制藥領(lǐng)域，涉及一種促血小板生成素的融合蛋白及其制備方法和應(yīng)用，具體涉及一種酵母偏好密碼子編碼的促血小板生成素模擬肽(ThrombopoietinMimeticPeptide，TMP)二聯(lián)體與人血清白蛋白分子(HumanserumAlbumin，HSA)的融合蛋白。
技術(shù)介紹
在臨床上常會遇到由各種原因引起的原發(fā)性和繼發(fā)性血小板減少癥，如原發(fā)性血小板減少性紫癜、再生障礙性貧血以及腫瘤化/放療造成的血小板減少等。對于這類疾病，比較適合應(yīng)用長效升血小板藥物進(jìn)行救治，一方面，可以減少用藥次數(shù)，減少病人的針痛之苦；另一方面，可以減少藥物用量，降低治療費(fèi)用。血小板由巨核細(xì)胞產(chǎn)生，促進(jìn)巨核細(xì)胞的增殖、分化是提高血小板水平的主要手段。促血小板生成素(Thrombopoietin，TMP)，又稱巨核細(xì)胞生長發(fā)育因子(MGDF)，是骨髓巨核細(xì)胞增殖、分化和血小板生成的最重要調(diào)控因子。1994年TMP基因缺少注釋被首次成功克隆后不久，人們即研制出一種聚乙二醇(PEG)化的重組功能型TMP基因工程產(chǎn)品-PEG-rHuMGDF。動物實驗結(jié)果表明，PEG-rHuMGDF不僅具有突出的促血小板生成活性，而且在體內(nèi)具有較長的半衰期，單次應(yīng)用即可達(dá)到顯著升高血小板的效果。然而，在臨床試驗過程中人們發(fā)現(xiàn)，一些健康受試者在接受該藥物治療后所產(chǎn)生的抗體與內(nèi)源性TMP存在交差中和反應(yīng)，導(dǎo)致受試者出現(xiàn)血小板減少，從而使得PEG-rHuMGDF乃至重組人TMP的研制在1998年時即被美國FDA叫停。受其影響，在美、歐、日本等國家至今重組人TMP都未被批準(zhǔn)進(jìn)入臨床。人血清白蛋白分子(AlbuminHuman，HSA)是血漿中的主要蛋白成分，約占血漿總蛋白的50-60％。HSA分子是一種非糖基化單鏈蛋白，共由585個氨基酸殘基組成，其分子量為66.5kDa(A.Dugaiczyketal.，PNAS，1982，79：71-75)，血漿半衰期長達(dá)兩周以上。HSA分子在宿主細(xì)胞中是以一種原肽形式合成的，其中含24個氨基酸殘基組成的信號肽和前肽，在轉(zhuǎn)運(yùn)和分泌過程中信號肽和前肽被切除。HSA分子是一個穩(wěn)定的惰性蛋白，可以作為藥物載體。HSA分子以下同已成功地在多宿主中表達(dá)(EP330451和EP361991)，尤其在酵母細(xì)胞中可實現(xiàn)HSA分子較高水平的穩(wěn)定表達(dá)。當(dāng)目的多肽與HSA分子融合表達(dá)時不僅可以提高多肽藥物的穩(wěn)定性，還可以增加多肽藥物在體內(nèi)的半衰期。專利號CN201310084212.8的二聚體化融合蛋白的制備及應(yīng)用中公開了二聚體化促血小板生成素(TPO)模擬肽TMP二聯(lián)體-人血清白蛋白分子融合蛋白的制備及應(yīng)用，但是其存在融合蛋白表達(dá)效果不理想的問題，為了提高表達(dá)產(chǎn)量、增強(qiáng)融合蛋白的生物活性，本專利技術(shù)采用了酵母偏好密碼子編碼促血小板生成素模擬肽TMP二聯(lián)體的策略。基于上述研究現(xiàn)狀，本專利技術(shù)現(xiàn)提供一種促血小板生成素的融合蛋白，所述的促血小板生成素模擬肽TMP二聯(lián)體是由酵母偏好密碼子編碼而成的，所述融合蛋白能在酵母體內(nèi)高水平的穩(wěn)定表達(dá)，可應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)；同時，該融合蛋白具有顯著促進(jìn)血小板生成的特性，在人體內(nèi)具有較長的半衰期。本專利技術(shù)同時提供該融合蛋白的制備方法和應(yīng)用。重組蛋白的異源表達(dá)受到基因自身序列特征如密碼子偏好性、GC含量、mRNA二級結(jié)構(gòu)、mRNA穩(wěn)定性等因素的影響。研究表明同義密碼子的更換能夠影響蛋白質(zhì)翻譯延伸的速率[1-2]，說明密碼子的優(yōu)化可能會對重組蛋白的表達(dá)起到適得其反的影響。另一方面，重組蛋白的表達(dá)還受到宿主、培養(yǎng)條件、分泌途徑、啟動子等因素的影響，現(xiàn)行的基因優(yōu)化理論和設(shè)計方法還不成熟，存在著各種各樣的局限性，基因優(yōu)化策略對提高重組蛋白的表達(dá)量是必要條件，而不是充分條件。綜上所述，通過酵母偏好密碼子改造從而改良基因工程菌株表達(dá)量的策略在實際生產(chǎn)應(yīng)用中存在著極大的不確定性，針對不同的目的基因進(jìn)行改造，最終的結(jié)果是無法預(yù)知的。參考文獻(xiàn)：[1]KomarAA,LesnikT,ReissC.Synonymouscodonsubstitutionsaffectribosometrafficandproteinfoldingduringinvitrotranslation.FEBSLett,1999,462(3):387-391.[2]TrinhR,GurbaxaniB,MorrisonSL,etal.Optimizationofcodonpairusewithinthe(GGGGS)3linkersequenceresultsinenhancedproteinexpression.MolImmunol,2004,40(10):717-722.
技術(shù)實現(xiàn)思路
本專利技術(shù)的目的在于提供一種促血小板生成素的融合蛋白，該融合蛋白半衰期長，能在宿主體內(nèi)高水平穩(wěn)定表達(dá)。本專利技術(shù)的另一個目的是提供上述融合蛋白的制備方法。本專利技術(shù)的另一個目的是提供上述融合蛋白的應(yīng)用。本專利技術(shù)所述的上述目的是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的：本專利技術(shù)公開的一種促血小板生成素的融合蛋白，包括人血清白蛋白HSA分子、促血小板生成素模擬肽TMP二聯(lián)體，所述的人血清白蛋白HSA分子的氨基酸序列如SEQIDNO：4所示，或該氨基酸序列經(jīng)突變后具有同樣功能的序列，編碼所述HSA分子的氨基酸序列的DNA序列如SEQIDNO：3所示，所述的促血小板生成素模擬肽TMP二聯(lián)體的氨基酸序列如SEQIDNO：2所示，或該氨基酸序列經(jīng)突變后具有同樣功能的序列，促血小板生成素模擬肽TMP二聯(lián)體是由一個酵母偏好密碼子編碼而成的，編碼所述促血小板生成素模擬肽TMP二聯(lián)體的氨基酸序列的DNA序列如SEQIDNO：1所示，該融合蛋白還包括可形成二聚體化結(jié)構(gòu)域的肽段。本專利技術(shù)公開的一種促血小板生成素的融合蛋白，可形成二聚體化結(jié)構(gòu)域的肽段中含有至少兩個半胱氨酸。本專利技術(shù)公開的一種促血小板生成素的融合蛋白，可形成二聚體化結(jié)構(gòu)域的肽段中含有兩個半胱氨酸。本專利技術(shù)公開的一種促血小板生成素的融合蛋白，可形成二聚體化結(jié)構(gòu)域的肽段為H肽段，其氨基酸序列如SeqIDNo:8所示。本專利技術(shù)公開的一種促血小板生成素的融合蛋白，可形成二聚體化結(jié)構(gòu)域的肽段為H肽段和選自fip結(jié)構(gòu)域的肽段，H肽段的氨基酸序列如SeqIDNo:8所示，選自fip結(jié)構(gòu)域的肽段的氨基酸序列如SeqIDNo:10所示。本專利技術(shù)公開的一種促血小板生成素的融合蛋白，其中HSA分子連接于融合蛋白的C-末端，結(jié)構(gòu)式表示為HSA-L3-H-L4-TMP-L1-TMP，L1、L3、L4表示肽接頭，L1的氨基酸序列為GGPSG，L3的氨基酸序列為GGGGSGL，L4的氨基酸序列為EFGGGGS，H表示可形成二聚體化結(jié)構(gòu)域的H肽段。本專利技術(shù)公開的一種促血小板生成素的融合蛋白，其中HSA分子位于融合蛋白的N-末端，結(jié)構(gòu)式表示為TMP-L1-TMP-L2-H-fip-HSA，L1和L2表示肽接頭，L1的氨基酸序列為GGPSG，L2的氨基酸序列為GGGGSRS，H表示可形成二聚體化結(jié)構(gòu)域的H肽段，fip表示選自fip結(jié)構(gòu)域的肽段；所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO：6所示，編碼所述融合蛋白的核苷酸序列的DNA序列如SEQIDNO：5所示。本專利技術(shù)公本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點】
1.一種促血小板生成素的融合蛋白，包括人血清白蛋白HSA分子、促血小板生成素模擬肽TMP二聯(lián)體，所述的HSA分子的氨基酸序列如SEQ?ID?NO：4所示，或該氨基酸序列經(jīng)突變后具有同樣功能的序列，編碼所述HSA分子的氨基酸序列的DNA序列如SEQ?ID?NO：3所示，所述的促血小板生成素模擬肽TMP二聯(lián)體的氨基酸序列如SEQ?ID?NO：2所示，或該氨基酸序列經(jīng)突變后具有同樣功能的序列，其特征在于，所述的促血小板生成素模擬肽TMP二聯(lián)體是由一個酵母偏好密碼子編碼而成的，編碼所述促血小板生成素模擬肽TMP二聯(lián)體的氨基酸序列的DNA序列如SEQ?ID?NO：1所示，該融合蛋白還包括可形成二聚體化結(jié)構(gòu)域的肽段。

【技術(shù)特征摘要】
1.一種促血小板生成素的融合蛋白，包括人血清白蛋白HSA分子、促血小板生成素模擬肽TMP二聯(lián)體，所述的HSA分子的氨基酸序列如SEQIDNO：4所示，或該氨基酸序列經(jīng)突變后具有同樣功能的序列，編碼所述HSA分子的氨基酸序列的DNA序列如SEQIDNO：3所示，所述的促血小板生成素模擬肽TMP二聯(lián)體的氨基酸序列如SEQIDNO：2所示，或該氨基酸序列經(jīng)突變后具有同樣功能的序列，其特征在于，所述的促血小板生成素模擬肽TMP二聯(lián)體是由一個酵母偏好密碼子編碼而成的，編碼所述促血小板生成素模擬肽TMP二聯(lián)體的氨基酸序列的DNA序列如SEQIDNO：1所示，該融合蛋白還包括可形成二聚體化結(jié)構(gòu)域的肽段。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種促血小板生成素的融合蛋白，其特征在于，所述的可形成二聚體化結(jié)構(gòu)域的肽段中含有至少兩個半胱氨酸。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種促血小板生成素的融合蛋白，其特征在于，所述的可形成二聚體化結(jié)構(gòu)域的肽段中含有兩個半胱氨酸。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種促血小板生成素的融合蛋白，其特征在于，所述的可形成二聚體化結(jié)構(gòu)域的肽段為H肽段，其氨基酸序列如SeqIDNo:8所示。5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種促血小板生成素的融合蛋白，其特征在于，可形成二聚體化結(jié)構(gòu)域的肽段為H肽段和選自fip結(jié)構(gòu)域的肽段，H肽段的氨基酸序列如SeqIDNo:8所示，選自fip結(jié)構(gòu)域的肽段的氨基酸序列如SeqIDNo:10所示。6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種促血小板生成素的融合蛋白，其特征在于，所述HSA分子連接于融合蛋白的C-末端，結(jié)構(gòu)式表示為HSA-L3-H-L4-TMP-L1-TMP，L1、L3、L4表示肽接頭，L1的氨基酸序列為GGPSG，L3的氨基酸序列為GGGGSGL，L4的氨基酸序列為EFGGGGS，H表示可形成二聚體化結(jié)構(gòu)域的H肽段。7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種促血小板生成素的融合蛋白，其特征在于，所述HAS分子位于融合蛋白的N-末端，結(jié)構(gòu)式表示為TMP-L1-TMP-L2-H-fip-HSA，L1和L2表示肽接頭，L1的氨基酸序列為GGPSG，L2的氨基酸序列為GGGGSRS，H表示可形成二聚體化結(jié)構(gòu)域的H肽段，fip表示選自fip結(jié)構(gòu)域的肽段；所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO：6所示，編碼所述融合蛋白的核苷酸序列的DNA序列如SEQIDNO：5所示。8.權(quán)利要求6所述的一種促血小板生成素的融合蛋白形成的二聚體化融合蛋白。9.權(quán)利要求7所述的一種促血小板生成素的融合蛋白形成的二聚體化融合蛋白。10.一種促血小板生成素的融合蛋白，包括人血清白蛋白HAS分子、促血小板生成素模擬肽TMP二聯(lián)體，所述的人血清白蛋白HAS分子的氨基酸序列如SEQIDNO：4所示，或該氨基酸序列經(jīng)突變后具有同樣功能的序列，編碼所述HAS分子的氨基酸序列的DNA序列如SEQIDNO：3所示，所述的促血小板生成素模擬肽TMP二聯(lián)體的氨基酸序列如SEQIDNO：2所示，或該氨基酸序列經(jīng)突變后具有同樣功能的序列，其特征在于，所述的促血小板生成素模擬肽TMP二聯(lián)體是由一個酵母偏好密碼子編碼而成的，編碼所述的...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：李紅玉，張麗蕓，王梅竹，支德娟，李洋，趙晶，
申請(專利權(quán))人：蘭州大學(xué)，
類型：發(fā)明
國別省市：甘肅,62