IgG樣長效免疫融合蛋白及其應用制造技術

本發明專利技術公開了一種IgG樣長效免疫融合蛋白及其應用。本發明專利技術所提供的IgG樣長效免疫融合蛋白由效應分子和IgG抗體恒定區組成，所述效應分子通過連接肽與所述IgG抗體恒定區相連；所述效應分子為能在體內發揮生理學功能的蛋白；所述IgG抗體恒定區為IgG抗體去除兩個重鏈可變區和兩個輕鏈可變區后的結構。本發明專利技術所提供的IgG樣免疫融合蛋白，其在保證了與靶向分子具有較高親和力以及具有較好體內活性的前提下，可以有效延長蛋白藥物(效應分子)的生物半衰期，遠遠好于于同類的Fc免疫融合蛋白。本發明專利技術所提供的這種IgG樣長效免疫融合蛋白可用于糖尿病、腫瘤、自身免疫性疾病和內分泌等多種疾病的治療。

IgG like long-acting immune fusion protein and its application

The present invention discloses a IgG like long-acting immune fusion protein and its application. The long-acting IgG-like immunofusion protein provided by the present invention is composed of an effector molecule and a constant region of IgG antibody. The effector molecule is connected to the constant region of the IgG antibody by a connecting peptide; the effector molecule is a protein capable of performing physiological functions in vivo; and the constant region of the IgG antibody removes two variable regions of heavy chain and the constant region of the IgG antibody. The structure of the two light chain variable regions. The IgG-like immunofusion protein provided by the invention can effectively prolong the biological half-life of the protein drug (effector molecule) on the premise of ensuring high affinity with the target molecule and good in vivo activity, and is much better than the similar Fc immunofusion protein. The IgG-like long-acting immune fusion protein can be used for the treatment of diabetes, tumor, autoimmune diseases and endocrine diseases.

【技術實現步驟摘要】
IgG樣長效免疫融合蛋白及其應用
本專利技術屬于生物
，涉及一種IgG樣長效免疫融合蛋白及其應用。
技術介紹
重組蛋白藥物是生物技術藥物中很重要的一類，臨床上一般通過靜脈和皮下注射給藥。經靜脈和皮下注射后常伴有蛋白質降解，導致活性降低，生物利用度低；分子量較小者(小于60kD)甚至可以通過腎小球過濾到尿中，因而要達到需要的血藥濃度和治療效果需要反復給藥，有的需要一天注射2-3次，不僅給患者帶來不便，降低患者順應性，從而影響療效。因此臨床上需要研制長效的重組蛋白藥物。目前延長蛋白藥物半衰期的方法主要有：構建突變體通過構建突變體延長蛋白藥物半衰期，常用方法有：1、增加蛋白藥物的糖基化程度，使在蛋白藥物表面形成保護，，阻礙了蛋白酶對蛋白藥物的降解作用，增加蛋白質穩定性，同時使蛋白藥物分子量增大，減少了腎小球濾過。已經研制成功并上市的藥物如重組人EPO突變體(Amgen公司的Aranesp)和重組人胰島素的突變體(Aventis公司的Lantus)。Aranesp采用定點突變技術，N連接的寡糖鏈從原來的3條增加到5條，從而使分子量從原來的30kDa增加到50kDa，半衰期由原來的4-13h延長到平均49h。2、通過形成緩釋的微沉淀物，使釋放游離型藥物的時間延長。Lantus是從大腸桿菌K12株表達的重組人胰島素的突變體，在人胰島素A鏈第21個位點將Asp突變成Gly；在B鏈碳端最后第30個位點加兩個Arg，使胰島素等電點PI由原來的pH4.0變為pH6.7。這種突變使其在酸性環境下為完全澄清溶液，一旦注入皮下組織(pH值提高)則因為等電點特性，變成不溶的微沉淀物，可持續釋放，與重組人胰島素皮下注射后4-8h的持續時間相比，體內濃度相對恒定24小時以上。PEG化修飾PEG化(PEGylation)，即聚乙二醇(polyethylene,PEG)共價修飾蛋白質。PEG化蛋白藥物主要通過增加蛋白質的分子量，降低藥物從腎小管過濾，并且PEG可以作為屏障擋住蛋白質分子表面的抗原決定簇，減少免疫原性，減少體內清除率，PEG的屏障作用還可以保護蛋白質不易被蛋白酶水解，PEG化的這些特點均有利于延長蛋白藥物的半衰期。目前已上市的PEG化的蛋白藥物如PEG化的天冬酰胺酶(Enzon公司的Oncaspar)、PEG化的IFNα2b(Schering公司的PEGIntron)、PEG化的IFNα2a(Roche公司的Pegasys)和PEG化的G-CSF(Amgen公司的Neulasta)。血清白蛋白融合人血清，白蛋白(humanserumalbumin,HSA)是有585個氨基酸殘基的單鏈無糖基化的球形蛋白質，分子量65kDa，大多數治療用的蛋白和多肽半衰期一般較短，而HSA有將近長達19天的血清半衰期。臨床試驗結果表明，Albuferonα(HSA/IFNα融合蛋白)平均半衰期148小時，比Pegasys平均半衰期80小時(50-140小時)和PEGIntron平均半衰期40小時(22-60小時)更長。Albutropin是由HSA基因和重組人生長激素(rHGH)基因融合表達的蛋白。在猴子中，皮下注射albutropin(0.3mg/kg)和HGH(0.3mg/kg)相比，半衰期延長6倍，清除率慢8倍。人Fc制備的融合蛋白。白蛋白融合蛋白和Fc制備的融合蛋白的主要通過二種機制提高藥物在體內的生物半衰期，一個是增加其分子量的大小，使其不易被腎小管過濾出去；另一個是通過與新生兒Fc受體(neonatalFcreceptor,FcRn)的結合保護目標蛋白不輕易在血中清除(RathT,BakerK,DumontJA,etal.CritRevBiotechnol.2015Jun；35(2):235-54)。FcRn受體由fcgrt基因編碼，也被稱為Brambell受體，是通過非共價鍵與β2m微球蛋白形成異源二聚體的MHCI類樣的受體分子。FcRn受體與白蛋白和免疫球蛋白的結合有嚴格的pH依賴性，FcRn在生理條件下(pH7.4)不與白蛋白和免疫球蛋白結合。但當白蛋白和免疫球蛋白通過胞飲途徑內吞到細胞內，在酸性的溶酶體內(pH6.0-6.5)，FcRn與白蛋白和免疫球蛋白的親和力提高，形成復合物，FcRn保護白蛋白和免疫球蛋白不被降解，并通過膜質循環，將白蛋白和免疫球蛋白再次釋放到胞外。白蛋白和免疫球蛋白與FcRn結合可保護它們被代謝掉，延長二者的生物半衰期。目前，上市的白蛋白和免疫球蛋白產品有abatacept、aflibercept、belatacept、conbercept(四川康弘)、dulaglutide、etanercept和albutrepenonacogalfa等，其中etanercept和aflibercept為重磅炸彈級藥物，2016年etanercept全球銷售額達88.74億美元，aflibercept達50億美元，conbercept(四川康弘)在中國銷售額有望突破5億人民幣。然而，這些Fc免疫融合蛋白具有一個普遍的缺點，那就是生物半衰期較短。
技術實現思路
為了有效解決現有延長蛋白藥物生物半衰期方法的不足，本專利技術設計了IgG樣免疫融合蛋白，其可以有效延長蛋白藥物(效應分子)的生物半衰期，遠遠好于于同類的Fc免疫融合蛋白。本專利技術所提供的IgG樣免疫融合蛋白，具體是由效應分子和IgG抗體恒定區組成，所述效應分子通過連接肽與所述IgG抗體恒定區相連；所述效應分子為能在體內發揮生理學功能的蛋白；所述IgG抗體恒定區為IgG抗體去除兩個重鏈可變區和兩個輕鏈可變區后的結構。即，所述IgG樣免疫融合蛋白，與免疫球蛋白一樣，是一類由兩條輕鏈和兩條重鏈組成的四肽鏈結構，重鏈之間和重、輕鏈之間由二硫鍵連接，其構象與英文大寫字母Y形狀類似。輕鏈型別可為κ和λ型，包含輕鏈的恒定區(CL)。重鏈類別可為IgG1，IgG2和IgG4，包含重鏈的恒定區(CH1、CH2和CH3)。其中，所述連接肽的氨基酸序列可選自如下中任一：AKTTPKLEEGEFSEAR(序列1)；AKTTPKLEEGEFSEARV(序列2)；AKTTPKLGG(序列3)；SAKTTPKLGG(序列4)；SAKTTP(序列5)；RADAAP(序列6)；RADAAPTVS(序列7)；RADAAAAGGPGS(序列8)；RADAAAA(序列9)；SAKTTPKLEEGEFSEARV(序列10)；ADAAP(序列11)；DAAPTVSIFPP(序列12)；TVAAP(序列13)；TVAAPSVFIFPP(序列14)；QPKAAP(序列15)；QPKAAPSVTLFPP(序列16)；AKTTPP(序列17)；AKTTPPSVTPLAP(序列18)；AKTTAP(序列19)；AKTTAPSVYPLAP(序列20)；ASTKGP(序列21)；ASTKGPSVFPLAP(序列22)；GGGGSGGGGSGGGGS(序列23)；GENKVEYAPALMALS(序列24)；GPAKELTPLKEAKVS(序列25)；GHEAAAVMQVQYPAS(序列26)。所述效應分子通過所述連接肽以下述8種方式中的任一種與所述IgG抗體恒定區相連：方式1：所述效應分子通過所述連接肽分別連接本文檔來自技高網...

【技術保護點】
1.IgG樣免疫融合蛋白，由效應分子和IgG抗體恒定區組成，所述效應分子通過連接肽與所述IgG抗體恒定區相連；所述效應分子為能在體內發揮生理學功能的蛋白；所述IgG抗體恒定區為IgG抗體去除兩個重鏈可變區和兩個輕鏈可變區后的結構。

【技術特征摘要】
1.IgG樣免疫融合蛋白，由效應分子和IgG抗體恒定區組成，所述效應分子通過連接肽與所述IgG抗體恒定區相連；所述效應分子為能在體內發揮生理學功能的蛋白；所述IgG抗體恒定區為IgG抗體去除兩個重鏈可變區和兩個輕鏈可變區后的結構。2.根據權利要求1所述的IgG樣免疫融合蛋白，其特征在于：所述連接肽的氨基酸序列選自序列表中序列1至序列26中任一。3.根據權利要求1或2所述的IgG樣免疫融合蛋白，其特征在于：所述效應分子通過所述連接肽以下述八種方式中的任一種與所述IgG抗體恒定區相連：方式1：所述效應分子通過所述連接肽分別連接于所述IgG抗體恒定區的兩條重鏈和兩條輕鏈的N端；方式2：所述效應分子通過所述連接肽連接于所述IgG抗體恒定區的兩條重鏈的C端，不連接輕鏈；方式3：所述效應分子通過所述連接肽連接于所述IgG抗體恒定區的兩條輕鏈的N端，不連接重鏈；方式4：所述效應分子通過所述連接肽連接于所述IgG抗體恒定區的兩條輕鏈的C端，不連接重鏈；方式5：所述效應分子通過所述連接肽分別連接于所述IgG抗體恒定區的兩條重鏈的N端，不連接輕鏈；方式6：所述效應分子通過所述連接肽分別連接于所述IgG抗體恒定區的兩條重鏈的N端和兩條輕鏈的C端；方式7：所述效應分子通過所述連接肽分別連接于所述IgG抗體恒定區的兩條重鏈和兩條輕鏈的C端；方式8：所述效應分子通過所述連接肽分別連接于所述IgG抗體恒定區的兩條輕鏈的N端和兩條重鏈C端。4.根據權利要求1-3中任一所述的IgG樣免疫融合蛋白，其特征在于：所述效應分子作用的靶向分子為糖尿病治療的靶向分子、自身免疫性疾病治療的靶向分子、腫瘤治療的靶向分子或內分泌治療的靶向分子。5.根據權利要求4所述的IgG樣免疫融合蛋白，其特征在于：所述糖尿病治療的靶向分子為胰高血糖素樣肽1受體、成纖維細胞生長因子受體或其他靶向分子；所述自身免疫性疾病治療的靶向分子選自如下任一種：腫瘤壞死因子α、IL-1、IL-4、IL-5、IL-8、IL-13、IL-17、IL-23、CD80、CD86、CD2、CD110、CD257、B淋巴細胞刺激因子，以及其他靶向分子；所述腫瘤治療的靶向分子選自如下任一種：血管內皮生長因子A、Fas配體、生長分化因子2、Wnt、骨形態發生蛋白11、激活素A，以及其他靶向分子；所述內分泌治療的靶向分子為生長激素受體或甲狀旁腺激素受體。6.根據權利要求5所述的IgG樣免疫融合蛋白，其特征在于：作用于糖尿病治療靶向分子胰高血糖素樣蛋白1受體的所述效應分子為GLP-1或GLP-1類似物；作用于糖尿病治療靶向分子成纖維細胞生長因子受體的所述效應分子為成纖維細胞生長因子21；作用于自身免疫性疾病治療的靶向分子腫瘤壞死因子α的所述效應分子為腫瘤壞死因子受體1或腫瘤壞死因子受體2；作用于自身免疫性疾病治療的靶向分子CD80和CD86的所述效應分子為細胞毒T淋巴細胞相關抗原4；作用于自身免疫性疾病治療的靶向分子CD2的所述效應分子為CD58；作用于自身免疫性疾病治療的靶向分子B淋巴細胞刺激因子的所述效應分子為穿膜蛋白活化物；作用于自身免疫性疾病治療的靶向分子CD257的所述效應分子為CD268；作用于自身免疫性疾病治療的靶向分子CD11...

【專利技術屬性】
技術研發人員：胡品良，何蕓，鄒敬，洪偉東，宋凌云，楊澤榮，
申請(專利權)人：北京比洋生物技術有限公司，
類型：發明
國別省市：北京,11