FGF1-FGF21嵌合蛋白及其治療糖尿病的應用制造技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)提供了FGF1?FGF21嵌合蛋白，其包括FGF1突變體和FGF21的C尾，其減少促細胞分裂和增殖副作用，并且具有長效的降糖、降脂等活性。

FGF1-FGF21 chimeric protein and its application in the treatment of diabetes mellitus

The present invention provides a chimeric protein of FGF1_FGF21, which includes a mutant of FGF1 and a C tail of FGF21. The chimeric protein reduces the side effects of promoting cell division and proliferation, and has long-term hypoglycemic and lipid-lowering activities.

【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】
FGF1-FGF21嵌合蛋白及其治療糖尿病的應用
本專利技術(shù)屬于蛋白質(zhì)
，具體而言，本專利技術(shù)涉及長效FGF21的激動劑，其是FGF1-FGF21嵌合蛋白。另外本專利技術(shù)還涉及該蛋白的應用等，如治療糖尿病的應用。
技術(shù)介紹
成纖維細胞生長因子(FibroblastGrowthFactor，F(xiàn)GF)中共有18個家族成員，被分為5個旁分泌和1個內(nèi)分泌亞家族。FGF作用的發(fā)揮則是通過與細胞表面具有酪氨酸激酶活性的FGF受體(FGFReceptor，F(xiàn)GFR)相互作用進而引起受體的二聚化并進一步激活下游級聯(lián)信號來實現(xiàn)的。其中，成纖維細胞生長因子21(FGF21)是內(nèi)分泌作用的FGF19亞家族的成員。由于FGF21在代謝和安全性方面的優(yōu)點，它被寄予作為糖尿病、肥胖和脂肪代謝異常(dyslipidemia)的藥物的厚望。然而它的體內(nèi)藥效和半衰期卻不理想，因此現(xiàn)有技術(shù)對它的研究包括，將FGF21與Fc融合，定點突變FGF21上蛋白酶裂解位點，F(xiàn)GF21與靶向性抗體融合，PEG化。本專利技術(shù)人跳出了現(xiàn)有技術(shù)研究的框架，經(jīng)過長期研究，令人意外地發(fā)現(xiàn)了一種長效FGF21的激動劑，其是FGF1-FGF21嵌合蛋白，但是并不包括FGF1-FGF21的全部部分，不但引入有限的突變，即可使得其僅能與FGFR形成較弱的二元復合物即可啟動代謝調(diào)控的信號通路，而基本喪失了促細胞分裂和增殖的功能，同時，只使用了一小部分FGF21，又提供了長效的降糖等藥理作用。
技術(shù)實現(xiàn)思路
本專利技術(shù)要解決的技術(shù)問題在于提供新的FGF1-FGF21嵌合蛋白，其基本消除了促細胞分裂和增殖的能力，不但仍舊保留了FGF21的降血糖、降血脂等功能，而且可以長效地起效。另外，本專利技術(shù)還提供了該突變體的編碼基因、表達載體和宿主細胞以及醫(yī)藥用途等。具體而言，在第一方面，本專利技術(shù)提供了FGF1-FGF21嵌合蛋白，其包括FGF1突變體和FGF21的C尾，其中FGF1突變體的促細胞分裂和增殖的能力減少。本專利技術(shù)第一方面的嵌合蛋白減少(優(yōu)選消除)促細胞分裂和增殖的能力，不但仍舊保留了FGF21的降血糖、降血脂等功能，而且可以長效地起效。優(yōu)選本專利技術(shù)第一方面的嵌合蛋白由FGF1突變體和FGF21的C尾組成，更優(yōu)選其從N端到C端由FGF1突變體和FGF21的C尾組成。優(yōu)選在本專利技術(shù)第一方面的嵌合蛋白中，F(xiàn)GF1突變體具有Lys127、Lys128和/或Lys133突變，優(yōu)選具有Lys127Asp、Lys128Gln和/或Lys133Val突變。在本文中，突變的表示采用本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的方式。例如，Lys127表示對第127位上的Lys進行突變；而Lys128Gln表示對第128位上的Lys進行突變，突變?yōu)镚ln。突變可以是添加、缺失和/或取代。本領(lǐng)域技術(shù)人員知曉，通過改變已知多肽的編碼基因序列并將其導入表達載體，可以制備出取代、添加和/或缺失了氨基酸殘基的多肽或蛋白質(zhì)，這些方法廣泛記載于《分子克隆實驗指南》等本領(lǐng)域公知的文獻中。在本專利技術(shù)的具體實施方式中，突變是取代。在本專利技術(shù)的具體實施方式中，該突變體(僅)具有Lys127Asp、Lys128Gln和Lysl33Val突變。優(yōu)選在本專利技術(shù)第一方面的嵌合蛋白中，F(xiàn)GF21的C尾包括FGF21第142-182位。在本專利技術(shù)的具體實施方式中，本專利技術(shù)第一方面的嵌合蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO：1所示。在第二方面，本專利技術(shù)提供了編碼本專利技術(shù)第一方面的嵌合蛋白的多核苷酸。在本文中，多核苷酸可以是DNA形式，也可以是RNA形式，優(yōu)選DNA形式。DNA形式包括天然cDNA和人工合成的cDNA，DNA可以是編碼鏈或模板鏈。通過常規(guī)技術(shù)，如PCR方法、重組法或人工合成的方法，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以很容易獲得編碼本專利技術(shù)的突變體的核酸分子多核苷酸或其片段。這些序列一旦獲得，就可以將其克隆入載體，再轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染入相應的細胞，然后通過常規(guī)的宿主細胞進行增殖，從中分離得到大量的核酸分子。在第三方面，本專利技術(shù)提供了一種載體，其含有本專利技術(shù)第二個方面所述的多核苷酸。在本文中，載體包括表達載體和克隆載體，是指本領(lǐng)域中常用的細菌質(zhì)粒、粘粒、噬菌粒、酵母質(zhì)粒、植物細胞病毒、動物病毒及其它各種病毒載體。本專利技術(shù)中適用的載體包括但不限于：在細菌中表達用的載體(原核表達載體)、在酵母中表達用的載體(如畢赤酵母載體、漢遜酵母載體等)、在昆蟲細胞中表達的桿狀病毒載體、在哺乳動物細胞中表達用的載體(痘苗病毒載體、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、腺病毒載體、腺伴病毒載體等)、在植物中表達用的植物病毒載體以及在哺乳動物乳腺中表達用的各種載體。總之，只要能在宿主細胞中穩(wěn)定復制，任何質(zhì)粒和載體都可使用。優(yōu)選表達載體包含選擇標記基因，如細菌的氨芐青霉素抗性基因、四環(huán)素抗性基因、卡那霉素抗性基因、鏈霉素抗性基因、氯霉素抗性基因；酵母菌的新霉素抗性基因、Zeocin抗性基因，酵母菌的缺陷選擇標志，如His，Leu，Trp等；真核細胞的新霉素抗性基因、Zeocin抗性基因、二氫葉酸還原酶基因及熒光蛋白標記基因等。在本專利技術(shù)的具體實施方式中，使用的是已經(jīng)商品化的pET質(zhì)粒。在第四方面，本專利技術(shù)提供了一種細胞，如宿主細胞，其含有本專利技術(shù)第二個方面所述的多核苷酸。本專利技術(shù)的細胞可以含有本專利技術(shù)第三方面的載體，也可以用本專利技術(shù)第二方面的多核苷酸轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染。宿主細胞可以是原核細胞，也可以是真核細胞，如，細菌細胞、酵母細胞、植物細胞、昆蟲細胞、哺乳動物細胞等。宿主細胞在轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染含本專利技術(shù)所述編碼融合蛋白的基因序列后，即構(gòu)成工程化細胞或細胞株，可用于生產(chǎn)所需融合蛋白。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠恰當?shù)剡x擇適當?shù)妮d體、宿主細胞，并熟知如何將載體高效地轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染入宿主細胞中，所用方法包括但不限于：氯化鈣法、電穿孔法用于細菌細胞，電穿孔法和原生質(zhì)體融合法用于酵母細胞，脂質(zhì)體包裹、磷酸鈣共沉淀、電融合法以及顯微注射法用于哺乳動物細胞等真核細胞。優(yōu)選本專利技術(shù)的宿主細胞是大腸桿菌BL21(DE3)。在第五方面，本專利技術(shù)提供了藥物組合物，其包含本專利技術(shù)第一方面的突變體以及藥學上可接受的載體。本專利技術(shù)的藥物組合物能治療糖尿病、降血糖、治療或預防肥，并且其減少(甚至消除)促細胞增殖的副作用，而且還能夠長效地起效。在本文中，長效指的是具有比野生型FGF21更長體內(nèi)半衰期。在本文中，藥學上可接受的載體指無毒的填充劑、穩(wěn)定劑、稀釋劑、佐劑或其他制劑輔料。根據(jù)本領(lǐng)域的公知技術(shù)，可以根據(jù)治療目的、給藥途徑的需要將藥物組合物制成各種劑型，優(yōu)選該組合物為單位劑量形式，如凍干劑、片劑、膠囊、粉劑、乳液劑、注射劑或噴霧劑，更優(yōu)選該藥物組合物為注射劑型，如凍干粉針劑。也優(yōu)選該藥物組合物是液體制劑，如可以包含緩沖液(如磷酸鹽緩沖液、Tris-HCl緩沖液)。在第六方面，本專利技術(shù)提供了本專利技術(shù)第一方面的嵌合蛋白在制備減少促細胞分裂和增殖副作用的長效FGF21藥物中的應用。在本文中，F(xiàn)GF21藥物指的是用語預防或治療野生型FGF21可用于預防或治療的疾病的藥物。本專利技術(shù)的嵌合蛋白及其藥物能夠顯著降低(甚至基本消除)這樣的副作用，從而能夠長期安全地給藥。本專利技術(shù)的嵌合蛋白及其藥物基本保留了的降糖的功能。因此，優(yōu)選在本專利技術(shù)第六方面的應用中，藥物用于降血糖。也優(yōu)選在本專利技術(shù)第六方面的應用中，藥物用于治療糖尿病，尤其是2型糖尿病。本專利技術(shù)的嵌本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護點】
1.FGF1?FGF21嵌合蛋白，其包括FGF1突變體和FGF21的C尾，其中FGF1突變體的促細胞分裂和增殖的能力減少，優(yōu)選其由FGF1突變體和FGF21的C尾組成，更優(yōu)選其從N端到C端由FGF1突變體和FGF21的C尾組成。

【技術(shù)特征摘要】
1.FGF1-FGF21嵌合蛋白，其包括FGF1突變體和FGF21的C尾，其中FGF1突變體的促細胞分裂和增殖的能力減少，優(yōu)選其由FGF1突變體和FGF21的C尾組成，更優(yōu)選其從N端到C端由FGF1突變體和FGF21的C尾組成。2.權(quán)利要求1所述的嵌合蛋白，其中，F(xiàn)GF1突變體具有Lys127、Lys128和/或Lys133突變，優(yōu)選具有Lys127Asp、Lys128Gln和/或Lys133Val突變。3.權(quán)利要求1所述的嵌合蛋白，其中，F(xiàn)GF21的C尾包括FGF21第142-182位。4.權(quán)...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：黃志鋒，牛建樓，趙龍偉，穆薩·穆罕默迪，
申請(專利權(quán))人：黃志鋒，溫州木沙生物科技有限公司，
類型：發(fā)明
國別省市：浙江,33