一種高酶活谷氨酰胺轉氨酶菌株及其應用制造技術

本發明專利技術屬于微生物發酵技術領域，具體涉及一種高酶活谷氨酰胺轉氨酶菌株及其應用。本發明專利技術提供的高酶活谷氨酰胺轉氨酶新菌株為茂源鏈輪絲菌(Streptomyces?sp.)KL?Q1，其具有產谷氨酰胺轉胺酶活性高和發酵能力強的優點，其發酵生產谷氨酰胺轉氨酶的酶活大于25U/ml。同時，本發明專利技術提供的利用茂源鏈輪絲菌(Streptomyces?sp.)KL?Q1發酵生產谷氨酰胺轉氨酶的方法操作簡單，成本低，有利于該方法的推廣和應用。

【技術實現步驟摘要】
一種高酶活谷氨酰胺轉氨酶菌株及其應用
本專利技術屬于微生物發酵
，具體涉及一種高酶活谷氨酰胺轉氨酶菌株及其應用。
技術介紹
谷氨酰胺轉氨酶(簡稱TGase)又稱為轉谷氨酰胺酶，其是由331個氨基組成的具有活性中心的單體蛋白質酰基轉移酶，廣泛存在于動、植物和微生物機體組織中。TGase的主要作用是在蛋白質之間架橋生成ε-(γ-谷氨酰基)賴氨酸異肽鍵，從而催化蛋白質或多肽分子間形成共價交聯及蛋白質分子內谷氨酰胺基的水解，形成分子內和分子間的網狀結構，進而改善蛋白質的結構和功能特性甚至帶來新的功能。20世紀80年代末，ANDOH等以鏈輪絲菌Streptoverticillium發酵生產谷氨酰胺轉氨酶，經分離提取而得到純化了174倍的酶。谷氨酰胺轉氨酶能催化許多蛋白質進行共價交聯聚合，改善各種蛋白質的功能特性，在食品工業、紡織工業和醫藥工業上具有廣泛的應用前景及優勢。目前，對谷氨酰胺轉氨酶的研究主要集中在菌株的分離和選育、發酵條件和分離純化等方面，尤其對于生產谷氨酰胺轉胺酶的新菌株誘變分離的研究更為廣泛。專利文獻CN03152956.9公開了一種谷氨酰胺轉胺酶高產菌及其篩選方法和用該菌株發酵法生產谷氨酰胺轉胺酶，所述的菌種為一株吸水鏈(Streptomyceshygeroscopicus)，保藏號為CCTCCNO：M203062，是從奶牛廠土壤中經平板菌落特征初篩，采用一級發酵逐一搖瓶培養，利用標準色帶進行對比測試，再經酶活測定，比較谷氨酰胺轉胺酶活性大小而得到。經液體深層發酵可得谷氨酰胺轉胺酶，酶活為5.0U/ml。該谷氨酰胺轉胺酶可用于食品工業蛋白質交聯劑。專利文獻CN103981130A公開了一株谷氨酰胺轉氨酶高產菌及其應用，所述谷氨酰胺轉氨酶高產菌的分類命名為吸水鏈霉菌(streptomyceshygroscopicus)NYU-70，已保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏編號為CCTCCM2014121。該以吸水鏈霉菌是以(streptomyceshygroscopicus)NY-1為出發菌株，進行低能離子注入誘變，誘變后菌株經酪蛋白凝膠法比較，比色法進一步測定酶活性，篩選出產谷氨酰胺轉氨酶活性較高的突變株，作為下一輪誘變的出發菌，重復上述步驟篩選得到。該菌株發酵產谷氨酰胺轉氨酶活性高，遺傳穩定性好。利用該突變株進行液體搖瓶發酵可得谷氨酰胺轉氨酶，酶活為16.9U/mL。目前，生產谷氨酰胺轉胺酶的新菌株產谷氨酰胺轉氨酶的酶活力較低，酶活不超過20U/mL，而且其發酵條件篩選不理想，導致產谷氨酰胺轉胺酶菌株的發酵能力較低。因此，提供一種高酶活谷氨酰胺轉氨酶菌株或者是理想的發酵條件是目前亟需解決的難題。
技術實現思路
為了提高谷氨酰胺轉胺酶的產量，本專利技術提供了一種高酶活谷氨酰胺轉氨酶菌株及其應用，以解決上述缺陷。本專利技術提供了一株高酶活谷氨酰胺轉氨酶菌株，其分類命名為茂源鏈輪絲菌(Streptomycessp.)KL-Q1，于2018年5月18日保藏在廣東省微生物菌種保藏中心，保藏號為：GDMCCNo：60371，保藏地址：廣州市先烈中路100號大院59號樓5樓，廣東省微生物研究所。本專利技術提供的茂源鏈輪絲菌(Streptomycessp.)KL-Q1是以茂源鏈輪絲菌(Streptoverticilliummobarense)為出發菌，采用常壓室溫等離子體+紫外線進行誘變處理，誘變后經比色法挑選出酶活最高的10％株，重新做搖瓶發酵，再檢測，挑選出酶活最高的菌株作為下一輪誘變選育的出發菌，重復以上步驟，直至篩選到目標菌株茂源鏈輪絲菌(Streptomycessp.)KL-Q1。本專利技術的誘變原理為：本專利技術采用氦氣為工作氣體的常壓室溫等離子體源的活性能量粒子對菌株的遺傳物質造成損傷，并誘發生物細胞啟動SOS修復機制。SOS修復過程為一種高容錯率修復，因此修復過程中會產生種類豐富的錯配位點，并最終穩定遺傳進而形成突變株。本專利技術提供的高酶活谷氨酰胺轉氨酶菌株的誘變選育方法，具體步驟如下：(1)菌懸液制備：取30℃恒溫培養6d的茂源鏈輪絲菌(Streptoverticilliummobarense)，用無菌的生理鹽水洗下斜面上的孢子，倒入裝有玻璃珠的無菌三角瓶中，振蕩20min，用脫脂棉過濾，5000rpm離心10min后取沉淀洗滌復溶，制得孢子懸浮液，用血球計數板直接計數，調整孢子濃度約為106個/ml備用；(2)常壓室溫等離子體+紫外誘變：取分別0.1ml步驟(1)中的菌懸液均勻涂布在多粒無菌載片上，置于常壓室溫等離子體誘變機中，分別每隔20s為一個梯度，處理20～100s。處理完畢后，取出載片，分別放入預先裝有1ml無菌生理鹽水的的EP管中進行洗脫2min，抽取0.1ml洗脫液涂布到平板培養基上，結合紫外燈照射，用15W紫外燈管，把上述涂布好的平板置于燈管正下方，分別處理20～100s，處理完畢之后在30℃下倒置培養7d；(3)搖瓶發酵：將步驟(2)篩選到的生長良好的菌株接種至斜面培養基，在30℃下培養6d，取斜面培養物接種至種子液培養基，250ml三角瓶中裝液量50ml，于28℃恒溫搖床，轉速為300rpm培養20h，后以10％的接種量接種至發酵液培養基，250ml三角瓶中裝液量為50ml，于28℃恒溫搖床，轉速為300rpm，培養40h；(4)酶活檢測：比色法測定酶活，以CBZ-Gln-Gly為作用底物，L-谷氨酸-γ-單羥肟酸標準曲線。1個單位的TGase酶活定義為：37℃時每分鐘催化形成1μmol的L-谷氨酸-γ-單羥肟酸的酶量(U/mL)。試劑A：0.2mol/LTris-鹽酸緩沖液(pH6.0)，0.1mol/L羥胺，0.01mol/L還原型谷胱甘肽，0.03mol/L苯甲基氧化碳酰-L-谷氨酰胺甘氨酸(CBZ-Gln-Gly)；試劑B：3mol/L鹽酸，12％三氯乙酸，5％六水三氯化鐵(溶解于0.1mol/L鹽酸中)；2mL試劑A中加入0.2mL酶液，在37℃反應10min，加入2mL試劑B使反應終止，所形成紅色的鐵化合物，在525nm處比色，對照組用失活的酶液；同批次挑選出酶活最高的10％株，重新做搖瓶發酵，再檢測，挑選出酶活最高的菌株作為下一輪誘變選育的出發菌，重復以上步驟，直至篩選到目標菌株；(5)培養基成分：所述步驟(1)中的平板培養基和步驟(2)中的斜面培養基為：可溶性淀粉22～28g/L，酵母浸膏3～8g/L，磷酸二氫鉀1～3g/L，硫酸鎂1～3g/L，瓊脂15～25g/L，其余為水，初始pH為7.3；所述步驟(3)中的種子液培養基為：甘油18～22g/L，酵母浸膏8～12g/L，大豆蛋白粉8～12g/L，魚蛋白胨12～16g/L，磷酸二氫鉀1～3g/L，硫酸鎂1～3g/L，初始pH為7.3；所述步驟(3)中的發酵液培養基為：甘油18～22g/L，酵母浸膏12～18g/L，大豆蛋白粉3～8g/L，魚蛋白胨18～22g/L，磷酸二氫鉀1～3g/L，硫酸鎂1～3g/L，輕質碳酸鈣3～8g/L，初始pH為7.3。另外，本專利技術還提供了所述的高酶活谷氨酰胺轉氨酶菌株在發酵產谷氨酰胺轉氨酶中的應用。進一步地，所述的高酶活谷氨酰胺轉氨酶菌株在發酵產谷氨酰胺轉氨酶的具體步驟為：S1平板培養：將本文檔來自技高網...

【技術保護點】
1.一株高酶活谷氨酰胺轉氨酶菌株，其分類命名為茂源鏈輪絲菌(Streptomyces?sp.)KL?Q1，于2018年5月18日保藏在廣東省微生物菌種保藏中心，保藏號為：GDMCC?No：60371，保藏地址：廣州市先烈中路100號大院59號樓5樓，廣東省微生物研究所。

【技術特征摘要】
1.一株高酶活谷氨酰胺轉氨酶菌株，其分類命名為茂源鏈輪絲菌(Streptomycessp.)KL-Q1，于2018年5月18日保藏在廣東省微生物菌種保藏中心，保藏號為：GDMCCNo：60371，保藏地址：廣州市先烈中路100號大院59號樓5樓，廣東省微生物研究所。2.如權利要求1所述的高酶活谷氨酰胺轉氨酶菌株在發酵產谷氨酰胺轉氨酶中的應用。3.如權利要求2所述的高酶活谷氨酰胺轉氨酶菌株在發酵產谷氨酰胺轉氨酶中的應用，其特征在于，包括以下步驟：S1平板培養：將權利要求1所述的茂源鏈輪絲菌(Streptomycessp.)KL-Q1接種至平板培養基上培養，培養溫度為28～35℃，培養時間為6d；S2斜面培養：將步驟S1平板培養的茂源鏈輪絲菌(Streptomycessp.)KL-Q1接種至斜面培養基上培養，培養溫度為28～35℃，培養時間為6d；S3種液培養：將步驟S2中茂源鏈輪絲菌(Streptomycessp.)KL-Q1斜面培養物接種至種子液培養基中培養，培養溫度為25～30℃，搖床轉速為300rpm，恒溫培養20h；S4發酵培養：將步驟S3中茂源鏈輪絲菌(Streptomycessp.)KL-Q1的種子液按接種量為10％(v/v)接種至發酵培養基中，培養溫度為25～30℃，搖床轉速為300rpm，恒溫培養40h；S5干燥處理：將步驟S4得到的發酵液調節pH為6.0～8.0，壓濾，得濾液；將濾液經5～10微米孔徑袋濾過濾去除雜質，再經0.1～1微米孔徑濾棒微濾，最后經20000分子量超濾膜超濾8～15倍，得濃縮液，加入濃縮液體積5倍的體積濃度為95％酒精，于0～4℃的條件下攪拌靜止2h，懸浮液離心，得沉淀物，冷凍干燥，粉碎，即得。4.如權利要求3所述的高酶活谷氨酰胺轉氨酶菌株在發酵產谷氨酰胺轉氨酶中的應用，其特征在于，所述步驟S1的平板培養基和步驟S2的斜面培養基由以下組分組成：可溶性淀粉22～28g...

【專利技術屬性】
技術研發人員：李綺雯，容艷筠，羅苑華，李棟，杜敬河，伍劍聰，高健信，吳華庚，李華達，蔡永星，李成軒，邵錫賢，陳錫堂，劉曉君，李英明，
申請(專利權)人：廣東科隆生物科技有限公司，
類型：發明
國別省市：廣東,44