本發明專利技術公開了一種人工合成的Bt抗蟲基因JBT?AA及其應用，一種人工合成的Bt抗蟲基因JBT?AA，所述Bt抗蟲基因JBT?AA的核苷酸序列用SEQ?ID?No?1所示。上述人工合成的Bt抗蟲基因JBT?AA在制備抗蟲植物中的應用。人工合成的Bt抗蟲基因JBT?AA較其密碼子優化前更容易獲得穩定的轉基因植株。該基因可在轉基因玉米中穩定遺傳和表達，且表達量高，所得轉基因玉米抗蟲性好。
A Synthetic Bt Insect Resistance Gene JBT-AA and Its Application
The invention discloses a synthesized Bt insect-resistant gene JBT AA and its application, and a synthesized Bt insect-resistant gene JBT AA. The nucleotide sequence of the Bt insect-resistant gene JBT AA is shown by SEQ ID No.1. The application of the synthesized Bt insect-resistant gene JBT AA in the preparation of insect-resistant plants. The synthesized Bt insect-resistant gene JBT AA is easier to obtain stable transgenic plants than before codon optimization. The gene can be inherited and expressed stably in transgenic maize with high expression and good insect resistance.
【技術實現步驟摘要】
一種人工合成的Bt抗蟲基因JBT-AA及其應用
本專利技術屬于抗蟲基因工程育種領域，具體涉及一種人工合成的Bt抗蟲基因JBT-AA及其應用。
技術介紹
玉米是世界上最重要的糧食作物之一，在我國大部分地區廣泛種植，是主要的糧食作物與經濟作物，其對保持農業結構穩定乃至糧食安全具有重要作用。玉米也是遭受蟲害最嚴重的農作物之一，現有玉米種質缺少抗蟲資源，傳統抗性育種途徑亦很難取得突破。基因工程技術可將殺蟲基因轉化入玉米，從而獲得新的抗蟲玉米品種。但是隨著轉基因抗蟲玉米種植規模不斷擴大，轉基因抗蟲玉米仍然存在很多問題。抗蟲范圍相對較小，而危害玉米的害蟲極多，玉米害蟲逐漸對抗蟲玉米產生抗性。蘇云金芽孢桿菌Bt(Bacillusthurngiensis)，是一種革蘭氏陽性菌，廣泛存在于土壤、水域、植物、昆蟲尸體中。Bt殺蟲蛋白是蘇云金芽孢桿菌在形成芽孢時所產生的一種蛋白質，對鱗翅目、同翅目、鞘翅目、雙翅目等昆蟲具有高度特異毒殺活性，被廣泛應用于制備生物農藥和植物基因工程。Cry類基因是Bt基因中最早被鑒定、分離并公布序列的一類基因，也是被發掘出最多新基因型，研究最徹底的一類Bt基因。Cry蛋白家族的三維結構典型特征是含有明顯能區分出來的三個Domain，即DomainⅠ、DomainⅡ、DomainⅢ。抗蟲基因雖然對人畜無毒，不破壞環境，但目前普遍存在獲得的轉基因植物抗蟲效率低的問題。抗蟲基因大多來源于細菌等微生物，其密碼子與植物有較大差異，因此，對天然Bt基因進行改造，合成新的抗蟲基因，使抗蟲基因適合在植物受體細胞中表達，從而提高轉基因植株的殺蟲性是目前急需解決的問題。
技術實現思路
本專利技術的目的是克服現有技術的不足，提供一種可在轉基因玉米中穩定遺傳和表達，所得轉基因玉米抗蟲性好的人工合成的Bt抗蟲基因JBT-AA。本專利技術的第二個目的是提供一種人工合成的Bt抗蟲基因JBT-AA的應用。本專利技術的技術方案概述如下：一種人工合成的Bt抗蟲基因JBT-AA，所述Bt抗蟲基因JBT-AA的核苷酸序列用SEQIDNo1所示。上述人工合成的Bt抗蟲基因JBT-AA在制備抗蟲植物中的應用。本專利技術的優點：人工合成的Bt抗蟲基因JBT-AA較其密碼子優化前更容易獲得穩定表達的轉基因植株，所得轉基因玉米抗蟲性好。本專利技術獲得高效適合用于玉米遺傳轉化的Bt抗蟲基因JBT-AA，創制出抗蟲效果好的轉基因玉米，為抗蟲玉米新品種培育提供新種質資源。附圖說明圖1為JBT-AA基因設計過程。圖2為JBT-AA基因的植物表達載體。圖3為轉JBT-AA基因的玉米RT-PCR檢測結果。具體實施方式以下的實施例便于更好地理解本專利技術，但并不限定本專利技術。下述實施例中所用方法如果沒有特別的說明，均為常規方法，所用術語和縮寫均是本領域技術人員通用的術語和縮寫。天塔五號玉米種子購自天津科潤津豐種業有限責任公司。本申請以玉米種為例，實驗證明，其它植物也可以用于本專利技術。C58農桿菌感受態購自武漢淼靈生物科技有限公司。含有基因Bar的質粒pCAMBIA3301購自武漢淼靈生物科技有限公司。實施例1JBT-AA基因的設計改造根據蘇云金芽孢桿菌Cry1Ac蛋白和Cry4Aa蛋白不同區域的活性分析及玉米基因組特點，我們對兩種蛋白對應的密碼子及編碼框進行了優化改造，分別命名為Cry1Ac-J和Cry4Aa-J。接著將Cry1Ac-J的DomainⅠ和DomainⅡ與Cry4Aa-J的DomainⅢ進行融合(見圖1)，獲得一條新的基因，命名為JBT-AA。基因JBT-AA中G的含量為22.86％；C的含量為24.35％；T的含量為26.77％，A的含量為26.02％。Bt抗蟲基因JBT-AA(簡稱JBT-AA基因)的核苷酸序列如SEQIDNo：1所示。實施例2JBT-AA基因的植物表達載體構建按照實施例1的方案我們合成了JBT-AA基因，同時在基因的5’端添加了BamHI的酶切位點，3’端添加了SalI的酶切位點。用BamHI、SalI對JBT-AA基因進行酶切，并回收JBT-AA基因片段，然后與BamHI、SalI酶切過得的已有植物表達載體pCAMBIA3301進行連接，得到含有JBT-AA基因的植物表達載體pCAMBIA3301-JBT-AA(見圖2)。實施例3JBT-AA基因轉化農桿菌。實驗中所用的農桿菌為C58菌株，重組質粒載體pCAMBIA3301-JBT-AA上構建有篩選基因Bar。將保存的C58農桿菌感受態從-80℃冰箱拿出100μL，放在冰上，取出3μLpCAMBIA3301-JBT-AA質粒與C58農桿菌100μL混勻，冰浴15min，放入冰上預冷的電擊杯中，1500V，電擊轉化。將菌液吸入1.5mL離心管中，加入400μLYEP液體培養基，于28℃振蕩培養3h，6000r/min，28℃，離心收集菌體，棄300μL上清，重懸菌體，涂板于28℃暗培養2天，篩選出轉化成功的轉化用農桿菌單菌落。實施例4農桿菌侵染液的制備從平板上挑取轉化用農桿菌單菌落接種于YEP液體培養基中(含100mg/L卡那霉素)，28℃、180r/min振蕩培養過夜，當農桿菌生長至對數生長期時(OD600為0.6，20℃，5000r/min離心7min收集菌體，用等體積侵染培養基重懸菌體，得到農桿菌侵染液。YEP培養基：10g/L蛋白胨+10g/L酵母提取物+5g/LNaCl，pH為7.0。侵染培養基：1/2MS+65g/L蔗糖+36.5g/L葡萄糖+150μmol/L乙酰丁香酮，pH為5.3。實施例5轉抗蟲基因JBT-AA玉米的獲得。1玉米芽尖的轉化。選取整齊飽滿的天塔五號玉米種子，70％酒精浸泡1min，0.1％升汞消毒12min，無菌水清洗3次后接入發芽培養基，26℃，黑暗條件下培養。待苗長至4-6cm時，在無菌條件下切除幼葉和胚芽鞘以露出芽尖生長點，并用滅過菌的手術刀輕輕劃傷用于侵染。將玉米芽尖浸泡在農桿菌侵染液中(含有150μmol/L乙酰丁香酮)，并置于真空干燥器中，在50kPa壓力下侵染20分鐘，侵染完后棄去菌液，用無菌濾紙吸去玉米芽尖表面多余的菌液，繼續放入發芽培養基中培養3天，得到玉米小苗。發芽培養基：1/2MS+30g/L蔗糖+7.5g/L瓊脂，pH為5.7。2轉化苗的移栽和篩選。洗去玉米小苗根部的培養基，移入裝有珍珠巖、蛭石、營養土的體積比為1:2:2的花盆中，放于溫室培養。待小苗長到5-7cm時將250mg/L的草胺膦水溶液，10mL/株，噴灑在葉片上進行抗性苗的篩選。3抗性植株的RT-PCR分子檢測。用非轉基因對照植株葉片和轉基因植株葉片(本實施例步驟2獲得的葉片)提取總RNA，反轉錄合成的cDNA作為模板，用JBT-AA特異性引物進行擴增，擴增出的片段大小為1737bp(SEQIDNo：1)。擴增反應程序為:94℃3min；(94℃30s，58℃30s，72℃30s，32個循環)；72℃延伸7min。引物為上游:atgattgatatctctttatc(SEQNO.2)；下游:gaccgggatgaactcaattt(SEQNO.3)。產物經0.9％瓊脂糖凝膠電泳檢測。如圖3所示，泳道1為Marker，泳道2-8為轉基因植株，泳道9為非轉基因對照，泳道10為質粒本文檔來自技高網...
【技術保護點】
1.一種人工合成的Bt抗蟲基因JBT?AA，其特征是所述Bt抗蟲基因JBT?AA的核苷酸序列用SEQ?ID?No?1所示。
【技術特征摘要】
1.一種人工合成的Bt抗蟲基因JBT-AA，其特征是所述Bt抗蟲基因JBT-AA的核苷酸序列用...
【專利技術屬性】
技術研發人員：王罡，李倩，季靜，孫培，
申請(專利權)人：天津大學，
類型：發明
國別省市：天津,12
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