親和層析定量檢測重組人α干擾素工藝中間體含量的方法技術

本發(fā)明專利技術涉及親和層析定量檢測重組人α干擾素生產工藝中間體含量的方法，包括：1)表達重組人α干擾素的工程菌構建；2)發(fā)酵工程菌并分離純化以可溶性蛋白或包涵體形式表達的目的蛋白。其中蛋白純化包括粗純和精純，利用硫酸銨鹽析沉淀獲得蛋白粗品，粗品經DEAE陰離子交換柱層析純化得到中間體，用單抗親和層析柱定量檢測中間體中重組人α干擾素的含量。本方法適于重組人α干擾素和重組集成干擾素生產工藝中間體的定量檢測，優(yōu)點是操作簡單、快速、準確，根據(jù)得到的干擾素濃度數(shù)據(jù)可以改進人們對生產過程的認知程度和控制程度，使得可靠、快速、直接、容易地評估干擾素生產關鍵環(huán)節(jié)成為可能，以實現(xiàn)精確質量控制的目的。

Quantitative Determination of Intermediates in Recombinant Human Interferon-alpha by Affinity Chromatography

The invention relates to a method for quantitative determination of the content of intermediate in the production process of recombinant human interferon-alpha by affinity chromatography, including: 1) construction of engineering bacteria expressing recombinant human interferon-alpha; 2) fermentation engineering bacteria and separation and purification of target proteins expressed in the form of soluble proteins or inclusion bodies. The crude protein was purified by ammonium sulfate precipitation. The crude protein was purified by DEAE anion exchange column chromatography. The recombinant human interferon-alpha in the intermediate was quantitatively detected by monoclonal antibody affinity chromatography. This method is suitable for quantitative detection of the intermediate of recombinant human interferon-alpha and recombinant integrated interferon production process. The advantages of this method are simple, fast and accurate. According to the obtained interferon concentration data, people's recognition and control of the production process can be improved, making it possible to evaluate the key links of interferon production reliably, quickly, directly and easily, so as to achieve accuracy. The purpose of quality control.

【技術實現(xiàn)步驟摘要】
親和層析定量檢測重組人α干擾素工藝中間體含量的方法
本專利技術涉及生物醫(yī)藥領域，具體地說，涉及親和層析定量檢測重組人α干擾素工藝中間體含量的方法。
技術介紹
質量可控是藥品研發(fā)、生產的重要環(huán)節(jié)，是保證藥品安全、有效的前提，也是新藥研究的主要課題之一。蛋白質含量測定法，是生物制品質量控制中最基本的分析方法之一。目前，藥品含量質量控制的重點主要集中在原液和制劑成品上，而忽略了對生產過程及其中間體的質量控制。且又由于藥品尤其是生物藥物制品工藝的復雜性，在每一次純化分離中均會有不同程度的主成分蛋白損失和相關蛋白干擾影響，因此對于含量復雜的中間體而言，建立一種特異性高，靈敏度強的中間品蛋白含量檢測方法，對于生物制品的工藝過程控制具有十分重要的作用。親和層析屬于液相色譜，它是以共價偶聯(lián)了親和配體的介質為固定相來吸附或研究與其發(fā)生相互作用的分子。親和配體可以是蛋白分子、酶、抗體、抗原，也可以是一段DNA或RNA序列、仿生染料、酶的底物或抑制劑、小分子化合物(如藥物或激素)等。很多親和配體具有很高的選擇性，將偶聯(lián)了配體的介質裝在柱子中，可以很好的用于分離、檢測或研究復雜樣品中的目標分子。親和層析介質主要由三部分組成：配體、間隔臂、基質。配體是決定親和層析成功與否的一個重要因素。根據(jù)配體的類型，可以將親和層析進行分類，如凝集素親和層析、硼酸鹽親和層析、免疫親和層析、金屬螯合親和層析等。在設計和使用親和層析柱時，偶聯(lián)配體所使用的基質的類型也很重要。以瓊脂糖或纖維素等多糖類物質為基質的親和層析介質常用于樣品預處理或者靶分子的分離純化。這種基質易于修飾和活化，有利于基質和配體的偶聯(lián)，并且具有較好的物理化學穩(wěn)定性，非特異性吸附少。首先，要選擇合適的樣品處理緩沖液以利于目標分子與配體的結合。將處理好的樣品上到親和層析柱上，與配體無相互作用或作用弱的分子從柱子上穿出；然后通過更改流動相的pH或添加競爭劑，使目標分子與配體解離從而被洗脫下來。根據(jù)目標分子的性質，可以通過紫外吸收、熒光、質譜等方法對其進行檢測。親和層析的分離過程簡單、快速，具有較高的選擇性。免疫親和層析是利用生物體內存在的抗原、抗體之間高度特異性的親和力進行分離的方法。多糖瓊脂糖凝膠載體通過CNRr活化后與具有免疫親和性的蛋白結合，產生的物質和N一羥基丁二酞亞胺作用，在具有抗體的溶液中反應，最后就能得到親和載體，可用來分離抗體和抗原。以抗體為配體，免疫親和層析可以用于分離純化激素、酶、多肽、病毒等。以抗原或蛋白A/G為配體，可以對抗體進行純化。免疫親和層析廣泛用于生物醫(yī)學和藥物分析中樣品的分離和預處理。另外，除了可以利用親和層析的吸附作用來富集目標分子外，同樣也可以利用親和層析來去除樣品中影響分析的分子。如在蛋白組學的研究中，可以用親和層析柱先去除白蛋白、IgG等高豐度蛋白，再研究低豐度蛋白。目前尚未見用免疫親和層析對蛋白中間體進行定量分析的相關報道，一方面，用于特異蛋白吸附的配基抗體不易大量獲得，另一方面，得到的抗體純度必須高以保證特異性。干擾素是細胞免疫的重要成分，目前廣泛應用于病毒性肝炎、腫瘤和一些其他病毒感染的治療中。干擾素的檢測和重組人干擾素的純化工藝均需要高質量的單克隆抗體，特別是在生產重組人干擾素工藝中，單克隆抗體親和層析是干擾素生產工藝中最重要的步驟，制備大劑量干擾素，需要高效單抗親和層析柱。特別是對于中間體含量復雜的重組人干擾素生產工藝來說，對其進行準確快速的濃度測定有難度，因此急需建立一套對生物藥物制品中間體含量質量控制的有效方法。
技術實現(xiàn)思路
本專利技術的目的是提供一種基于免疫親和層析定量檢測重組人α干擾素生產工藝中間體含量的方法。為了實現(xiàn)本專利技術目的，本專利技術提供的親和層析定量檢測重組人α干擾素生產工藝中間體含量的方法，包括以下步驟：1)表達重組人α干擾素的工程菌構建；2)發(fā)酵工程菌并分離純化以可溶性蛋白或包涵體形式表達的目的蛋白；其中，步驟2)蛋白純化包括粗純和精純，利用硫酸銨鹽析沉淀獲得蛋白粗品，粗品經DEAE陰離子交換柱層析純化得到中間體，用單抗親和層析柱定量檢測中間體中重組人α干擾素的含量。本專利技術利用固定化干擾素抗體純化相應的干擾素，主要包括3個步驟，首先用中性的緩沖溶液平衡親和柱，讓含有相應干擾素的溶液通過親和柱。其次是洗去非特異性吸附蛋白，在標準操作中，應該用同樣的緩沖液洗去非特異性結合的蛋白，但如果要達到更好的效果，可以用偏酸(pH值5.5)、偏堿(pH值8.5)或帶有表面活性劑的緩沖溶液洗柱子。最后是目的蛋白的洗脫，通常用pH值為2.0-2.5的緩沖溶液洗脫，為了保持抗體的天然構象，緩沖液的pH值也可以用1mol/L磷酸鹽緩沖液(pH值7.0)調整。對蛋白溶液，通常可以應用210-215nm或者是280nm處的紫外吸收法來檢測。這種方法得到的色譜圖一般包括兩個峰，第一個峰代表非特異性吸附的物質，第二個峰代表了被分析的物質，而且第二個峰的保留時間可以通過控制加入洗脫劑的時間而改變。對供試品色譜圖第二個峰進行積分，得到峰面積與標準品峰面積進行比對，即可得到供試品濃度。前述的方法，步驟2)用單抗親和層析柱定量檢測中間體中重組人α干擾素的含量，具體方法為：①用pH6.0-8.0的PBS液配制系列濃度的重組人α干擾素標準品溶液；②將標準品溶液加至平衡好的單抗親和層析柱中，依次用流動相A和流動相B進行洗脫，收集重組人α干擾素洗脫峰(用NaOH調pH至中性)，以標準品濃度對峰面積作圖，繪制標準曲線；③用pH6.0-8.0的PBS液配制中間體的供試品溶液至濃度0.5-30mg/mL(優(yōu)選1mg/mL)，將供試品溶液加至平衡好的單抗親和層析柱中，按照與步驟②相同的操作，并對供試品溶液洗脫峰的峰面積進行分析，代入上述標準曲線，即得供試品溶液中重組人α干擾素的含量水平；其中，步驟②、③中所述流動相A為15-100mM，pH6.0-8.0的PBS緩沖液；所述流動相B為含有0.05-0.2MGly和0.1-0.3MNaCl的水溶液，pH2-3。優(yōu)選地，所述流動相A為25mM，pH7.0的PBS緩沖液；所述流動相B為含有0.1MGly和0.2MNaCl的水溶液，pH2.5。步驟②具體為：用流動相A平衡所述單抗親和層析柱，然后將標準品溶液加至平衡好的單抗親和層析柱中，依次用不少于2個柱體積流動相A、不少于5個柱體積流動相B及不少于5個柱體積流動相A進行洗脫；流動相線速度為0.5-3cm/min(優(yōu)選1.274cm/min)；檢測波長為280nm。優(yōu)選地，依次用3個柱體積流動相A、6個柱體積流動相B及5個柱體積流動相A進行洗脫。步驟2)所述單抗親和層析柱中的填料是由抗重組人α干擾素單克隆抗體與CNBr-Act-Sepharose4B偶聯(lián)制備而成。其中，所述抗重組人α干擾素單克隆抗體由雜交瘤細胞BTP-mAb4D9D1E7分泌產生。BTP-mAb4D9D1E7是分泌抗重組人α干擾素和重組集成干擾素的單克隆抗體細胞系。該細胞系由國家實驗細胞資源共享平臺北京協(xié)和細胞資源中心提供。所述單克隆抗體可以中和重組人干擾素α1b、α2b、α2a和重組集成干擾素四種抗原。步驟2)所述單抗親和層析柱中填料的制備方法如下：將10-15mL1mMHCl加入1-5g的CNBr-Act-本文檔來自技高網...

【技術保護點】
1.親和層析定量檢測重組人α干擾素生產工藝中間體含量的方法，其特征在于，包括以下步驟：1)表達重組人α干擾素的工程菌構建；2)發(fā)酵工程菌并分離純化以可溶性蛋白或包涵體形式表達的目的蛋白；其中，步驟2)蛋白純化包括粗純和精純，利用硫酸銨鹽析沉淀獲得蛋白粗品，粗品經DEAE陰離子交換柱層析純化得到中間體，用單抗親和層析柱定量檢測中間體中重組人α干擾素的含量。

【技術特征摘要】
1.親和層析定量檢測重組人α干擾素生產工藝中間體含量的方法，其特征在于，包括以下步驟：1)表達重組人α干擾素的工程菌構建；2)發(fā)酵工程菌并分離純化以可溶性蛋白或包涵體形式表達的目的蛋白；其中，步驟2)蛋白純化包括粗純和精純，利用硫酸銨鹽析沉淀獲得蛋白粗品，粗品經DEAE陰離子交換柱層析純化得到中間體，用單抗親和層析柱定量檢測中間體中重組人α干擾素的含量。2.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟2)用單抗親和層析柱定量檢測中間體中重組人α干擾素的含量，具體方法為：①用pH6.0-8.0的PBS液配制系列濃度的重組人α干擾素標準品溶液；②將標準品溶液加至平衡好的單抗親和層析柱中，依次用流動相A和流動相B進行洗脫，收集重組人α干擾素洗脫峰，以標準品濃度對峰面積作圖，繪制標準曲線；③用pH6.0-8.0的PBS液配制中間體的供試品溶液至濃度0.5-30mg/mL，將供試品溶液加至平衡好的單抗親和層析柱中，按照與步驟②相同的操作，并對供試品溶液洗脫峰的峰面積進行分析，代入上述標準曲線，即得供試品溶液中重組人α干擾素的含量水平；其中，步驟②、③中所述流動相A為15-100mM，pH6.0-8.0的PBS緩沖液；所述流動相B為含有0.05-0.2MGly和0.1-0.3MNaCl的水溶液，pH2-3。3.根據(jù)權利要求2所述的方法，其特征在于，步驟②具體為：用流動相A平衡所述單抗親和層析柱，然后將標準品溶液加至平衡好的單抗親和層析柱中，依次用不少于2個柱體積流動相A、不少于5個柱體積流動相B及不少于5個柱體積流動相A進行洗脫；流動相線速度為0.5-3cm/min；檢測波長為280nm。4.根據(jù)權利要求2所述的方法，其特征在于，步驟2)所述單抗親和層析柱中的填料是由抗重組人α干擾素單克隆抗體與CNBr-Act-Sepharose4B偶聯(lián)制備而成；其中，所述抗重組人α干擾素單克隆抗體由雜交瘤細胞BTP-mAb4D9D1E7分泌產生。5.根據(jù)權利要求4所述的方法，其特征在于，步驟2)所述單抗親和層析柱中填料的制備方法如下：將10-15mL1mMHCl加入1-5g的CNBr-Act-Sepharose4B中浸泡凝膠，抽洗；然后，用偶聯(lián)緩沖液洗滌...

【專利技術屬性】
技術研發(fā)人員：楊大軍，茹莉莉，劉嫻，吳京雷，韓志剛，程永慶，
申請(專利權)人：北京三元基因藥業(yè)股份有限公司，
類型：發(fā)明
國別省市：北京,11