使用鏈置換的多重成像制造技術(shù)

本申請描述用于對樣品中的至少一個靶標進行成像的各種改進的實施方案，包括采用接頭鏈寡核苷酸和橋鏈寡核苷酸的實施方案。一些實施方案還采用反彈物寡核苷酸和/或阻斷物寡核苷酸。一些實施方案還使用兩個部分對接鏈來檢測所述部分對接鏈與彼此的鄰近性。

【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】
【國外來華專利技術(shù)】使用鏈置換的多重成像相關(guān)申請的交叉引用本申請要求2016年5月15日提交的美國臨時申請第62/336,676號和2016年5月31日提交的美國臨時申請第62/343,791號的優(yōu)先權(quán)的權(quán)益，所述申請出于所有目的以引用的方式整體并入本文。詳細描述
采用鏈置換的對樣品中的靶標的改進的多重成像。
技術(shù)介紹
DNA鏈置換是一種用于DNA復(fù)合物的等溫和動態(tài)交換的方法。1–3鏈置換可基于對DNA雜交相互作用和熱力學(xué)的理解來設(shè)計和有意識地控制，并且可通過引入已知為“立足點結(jié)構(gòu)域(toeholddomains)”的工程化手柄來促進。調(diào)控結(jié)合相互作用和交換雜交配偶體的能力產(chǎn)生一系列潛在的應(yīng)用。若干這些應(yīng)用已由Diehl和同事提出并證明，4–7包括使用免疫熒光顯微鏡法在固定細胞中進行多重蛋白質(zhì)檢測和信號擴增應(yīng)用。如由Diehl和同事提出的現(xiàn)有技術(shù)水平僅提供用于熒光顯微鏡法的鏈置換的窄實現(xiàn)方式。由Diehl和同事提出的設(shè)計可能是昂貴的，因為它需要在測定將不同的核酸序列綴合到每個靶標識別元件。鏈置換的效率不是最佳的，并且可能由于使用較長的DNA鏈而誘導(dǎo)不想要的非特異性結(jié)合。在此提出基于DNA鏈置換的新的意料之外的實施方案。
技術(shù)實現(xiàn)思路
根據(jù)本說明書，一種用于樣品中的至少一個靶標的成像的方法包括：(a)提供至少一種結(jié)合到接頭鏈寡核苷酸的靶標識別抗體；(b)提供具有能夠特異性地結(jié)合所述接頭鏈寡核苷酸的區(qū)域和對接鏈區(qū)域的橋鏈寡核苷酸；以及(c)提供能夠特異性地結(jié)合所述橋鏈寡核苷酸的所述對接鏈區(qū)域的成像物鏈寡核苷酸，其中所述成像物鏈用可檢測的標簽標記。在一些實施方案中，一種用于樣品中的至少一個靶標的成像的方法包括：(a)提供至少一種結(jié)合到對接鏈寡核苷酸的靶標識別抗體；(b)提供在第一區(qū)域上但是不在其全長或所述對接鏈的全長上與所述對接鏈雜交的阻斷物鏈；(c)提供至少在所述對接鏈的不與所述阻斷物鏈雜交的區(qū)域中與所述對接鏈寡核苷酸雜交的成像物鏈寡核苷酸，其中所述成像物鏈用可檢測的標簽標記；(d)使所述成像物鏈與所述對接鏈雜交，置換所述阻斷物鏈；(e)確定所述靶標識別抗體是否已結(jié)合到所述靶標。在一些實施方案中，一種用于樣品中的至少兩個靶標的成像的方法包括：(a)提供至少兩種結(jié)合到對接鏈寡核苷酸的靶標識別抗體；(b)提供能夠與所述第一靶標識別抗體上的所述對接鏈雜交的第一成像物鏈寡核苷酸并且提供能夠與所述第二靶標識別抗體上的所述對接鏈雜交的第一阻斷鏈，其中所述成像物鏈用可檢測的標簽標記并且所述阻斷鏈不用可檢測的標簽標記，并且其中任選地，如果存在多于兩種靶標識別抗體，則使用附加的阻斷鏈；(c)對所述第一靶標成像并且用至少一種反彈物鏈去除所述成像物鏈和所述阻斷鏈；(d)提供能夠與所述第二靶標識別抗體上的所述對接鏈雜交的第二成像物鏈寡核苷酸并且提供能夠與所述第一靶識別抗體上的所述對接鏈雜交的第二阻斷鏈，其中所述成像物鏈用可檢測的標簽標記并且所述阻斷鏈不用可檢測的標簽標記，并且其中任選地，如果存在多于兩種靶標識別抗體，則使用附加的阻斷鏈；(e)對所述第二靶標成像；以及(f)任選地用至少一種反彈物鏈去除所述成像物鏈和所述阻斷鏈，并且任選地針對任何附加靶標重復(fù)所述成像。在一些實施方案中，一種用于樣品中的至少一個靶標的成像的方法包括：(a)提供至少一種結(jié)合到第一對接鏈寡核苷酸的第一靶標識別抗體；(b)提供至少一種結(jié)合到第二對接鏈寡核苷酸的第二靶標識別抗體；(c)提供當(dāng)所述第一對接鏈寡核苷酸和所述第二對接鏈寡核苷酸彼此鄰近時能夠特異性地結(jié)合到所述第一對接鏈寡核苷酸和所述第二對接鏈寡核苷酸、從而形成全長對接鏈的成像物鏈寡核苷酸，其中所述成像物鏈不特異性地結(jié)合單獨的所述第一對接鏈寡核苷酸或所述第二對接鏈寡核苷酸；(d)檢測所述成像物鏈，其中所述成像物鏈被標記。另外的目的和優(yōu)點將部分陳述在隨后的描述中，并且將部分通過所述說明而顯而易見，或者可通過實踐而學(xué)到。所述目的和優(yōu)點將借助在所附權(quán)利要求中具體指出的要素和組合來實現(xiàn)和達到。應(yīng)理解，上述一般描述和以下詳細描述均僅為示例性和解釋性的并且不限制權(quán)利要求。并入本說明書并且構(gòu)成本說明書的一部分的附圖說明一個(若干)實施方案，并且與描述一起用于解釋本文所述的原理。附圖說明圖1示出用于將對接鏈連接到靶標的通用試劑的使用。101表示能夠結(jié)合到靶標的抗體。102和103的組合表示通用銜接子，其中102是抗體結(jié)合物并且103是通用接頭。104-105的組合表示具有與通用銜接子(103)和對接位點(105)互補的結(jié)構(gòu)域的橋鏈。圖2示出用于使用4向支鏈遷移引入和去除成像物鏈的動態(tài)復(fù)合物的使用。在一些實施方案中，圖2的靶標結(jié)合物可以是抗體。圖3示出引入成像物鏈的一個反應(yīng)(a)和將其從對接鏈去除的反應(yīng)(b和c)。圖4A至圖4D示出阻斷物鏈的使用的各種實施方案。圖4A示出結(jié)合到其三個相應(yīng)靶標并且具有三個對接鏈的三個初級抗體。在圖4B中，樣品用與對接鏈207互補的熒光標記的成像物鏈210處理。在對靶標204洗滌和成像之前，添加分別與對接鏈208和209互補的未標記阻斷物鏈211和212。在圖4B和圖4C中所示的視圖之間，添加與成像鏈210或阻斷物鏈211和212互補的反彈物鏈的混合物以去除這些鏈。圖4D示出使用熒光標記的成像物鏈214和用于其他對接鏈的阻斷物鏈進行的對靶標205的成像。圖5示出使用阻斷物鏈和反彈物鏈進行的交換成像。結(jié)合結(jié)構(gòu)域通過字母和指示互補對的具有星號的字母(例如，結(jié)構(gòu)域a與結(jié)構(gòu)域a*雜交)標記。首先，所有的靶標用核酸-靶標識別復(fù)合物染色，其中對接鏈可含有兩個結(jié)構(gòu)域(例如，a和b)。可引入所有靶標的阻斷物鏈，其中每個阻斷物鏈與對接鏈的至少一個結(jié)構(gòu)域(例如，b*)互補。然后，可引入正在成像的一個或多個靶標的成像物鏈并且在當(dāng)前的成像回合中置換僅待成像的一個或多個靶標的阻斷物鏈。在獲取圖像之后，引入含有與成像物鏈(例如，a、b和c)互補的結(jié)構(gòu)域的反彈物鏈以置換并洗去成像物鏈。可針對其他靶標的附加成像回合重復(fù)此循環(huán)以用于順序多重復(fù)用。圖6示出使用半通用阻斷物鏈和通用反彈物鏈進行的交換成像。圖7提供一種用于用成像物鏈的鏈置換進行多重鄰近檢測的方法。具體實施方式I.定義在一些實施方案中，對接鏈定義為通過中間體分子(例如，包括全長抗體及其抗原結(jié)合片段的抗體)附接到感興趣的靶標以形成核酸-靶標識別復(fù)合物的寡核苷酸。對接位點定義為具有對接鏈與成像物鏈之間的互補性或特異性結(jié)合親和力的區(qū)域。成像物鏈定義為附接到標簽(例如，熒光團、納米顆粒等)的寡核苷酸。阻斷物鏈定義為攜帶具有與對接鏈的互補性的區(qū)域的寡核苷酸，當(dāng)結(jié)合到對接鏈時，所述寡核苷酸阻斷與任何脫靶成像物鏈的締合；阻斷物鏈也可以是攜帶具有與成像物鏈的互補性的區(qū)域的寡核苷酸，當(dāng)結(jié)合到成像物鏈時，所述寡核苷酸阻斷與任何脫靶對接鏈的締合(參見圖2)。反彈物鏈定義為攜帶具有與阻斷物鏈或成像物鏈的互補性的區(qū)域的寡核苷酸，所述寡核苷酸引起結(jié)合到對接鏈的阻斷物鏈或成像物鏈的鏈置換。當(dāng)在整個申請中參考雜交或雜交條件時，可在室溫下采用高離子強度緩沖液條件(例如，1x鹽水檸檬酸鈉緩沖液，或150mM、200mM、300mM、400mM、500mM或600mM磷酸鈉緩沖液中的氯化鈉)以確保雜交發(fā)生。II.本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護點】
1.一種用于樣品中的至少一個靶標的成像的方法，其包括：a.提供至少一種結(jié)合到接頭鏈寡核苷酸的靶標識別抗體；b.提供具有能夠特異性地結(jié)合所述接頭鏈寡核苷酸的區(qū)域和對接鏈區(qū)域的橋鏈寡核苷酸；c.提供能夠特異性地結(jié)合所述橋鏈寡核苷酸的所述對接鏈區(qū)域的成像物鏈寡核苷酸，其中所述成像物鏈用可檢測的標簽標記。

【技術(shù)特征摘要】
【國外來華專利技術(shù)】2016.05.15 US 62/336,676;2016.05.31 US 62/343,7911.一種用于樣品中的至少一個靶標的成像的方法，其包括：a.提供至少一種結(jié)合到接頭鏈寡核苷酸的靶標識別抗體；b.提供具有能夠特異性地結(jié)合所述接頭鏈寡核苷酸的區(qū)域和對接鏈區(qū)域的橋鏈寡核苷酸；c.提供能夠特異性地結(jié)合所述橋鏈寡核苷酸的所述對接鏈區(qū)域的成像物鏈寡核苷酸，其中所述成像物鏈用可檢測的標簽標記。2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述接頭鏈寡核苷酸通過抗體結(jié)合物結(jié)合到所述靶標識別抗體。3.如權(quán)利要求1-2中任一項所述的方法，其中所述方法還包括去除未結(jié)合的靶標識別抗體、未結(jié)合的接頭鏈寡核苷酸和/或未結(jié)合的橋鏈寡核苷酸中的一個或多個的純化步驟。4.如權(quán)利要求1-3中任一項所述的方法，其中所述方法還包括添加至少一種不特異性地結(jié)合到所述樣品中的任何靶標的抗體。5.一種用于樣品中的至少一個靶標的成像的方法，其包括：a.提供至少一種結(jié)合到對接鏈寡核苷酸的靶標識別抗體；b.提供在第一區(qū)域上但是不在其全長或所述對接鏈的全長上與所述對接鏈雜交的阻斷物鏈；c.提供至少在所述對接鏈的不與所述阻斷物鏈雜交的區(qū)域中與所述對接鏈寡核苷酸雜交的成像物鏈寡核苷酸，其中所述成像物鏈用可檢測的標簽標記；d.使所述成像物鏈與所述對接鏈雜交，置換所述阻斷物鏈；e.確定所述靶標識別抗體是否已結(jié)合到所述靶標。6.如權(quán)利要求5所述的方法，其中所述成像物鏈在第一區(qū)域上但是不在其全長上與阻斷物鏈雜交。7.如權(quán)利要求5-6中任一項所述的方法，其中與所述對接鏈雜交的所述阻斷物鏈和與所述成像物鏈雜交的所述阻斷物鏈彼此雜交。8.如權(quán)利要求7所述的方法，其中所述第一阻斷物鏈和所述第二阻斷物鏈在其整個長度上彼此雜交。9.如權(quán)利要求5-8中任一項所述的方法，其中所述反彈物鏈寡核苷酸是在對多個靶標成像的情況下能夠與所有所述對接鏈雜交的通用反彈物鏈寡核苷酸。10.如權(quán)利要求5-9中任一項所述的方法，其中所述反彈物鏈寡核苷酸是在對多個靶標成像的情況下能夠與所有所述成像物鏈雜交的通用反彈物鏈寡核苷酸。11.一種用于樣品中的至少兩個靶標的成像的方法，其包括：a.提供至少兩種結(jié)合到對接鏈寡核苷酸的靶標識別抗體；b.提供能夠與所述第一靶標識別抗體上的所述對接鏈雜交的第一成像物鏈寡核苷酸并且提供能夠與所述第二靶標識別抗體上的所述對接鏈...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：陳曦，S·亨內(nèi)克，
申請(專利權(quán))人：烏爾蒂維尤股份有限公司，
類型：發(fā)明
國別省市：美國,US