含靜脈瓣的生物源性靜脈的制備方法技術

本發明專利技術公開了一種含靜脈瓣的生物源性靜脈的制備方法，其特征在于，步驟為：a、剪取直徑0.5～1.5cm，長3～5cm含有完整靜脈瓣的牛的頸靜脈，清理并消毒；b、對步驟a中得到的材料進行細胞裂解處理、細胞消化及核酸消化處理；c、將經過步驟b處理的材料依次進行共價鍵合肝素處理→離子結合肝素處理→共價鍵合肝素處理；d、將經過步驟c處理的材料浸入雷帕霉素溶液與PLGA的混合物并勻速拉動1～10分鐘，然后將靜脈內膜外翻同樣的步驟處理；自然晾干后放入20℃烘箱烘干12小時。本發明專利技術把雷帕霉素涂層到靜脈內膜和外膜，這樣處理的含靜脈瓣的牛頸靜脈植入狗靜脈后顯著抑制靜脈內膜及吻合口的增生。

Preparation of Biogenic Veins Containing Vein Valves

The invention discloses a method for preparing biogenic veins containing venous valves, which is characterized by the following steps: A. cutting the jugular veins of cattle with a diameter of 0.5-1.5 cm and a length of 3-5 cm containing intact venous valves, cleaning and disinfection; B. cell lysis, cell digestion and nucleic acid digestion of the materials obtained in step a; C. sequentially processing the materials processed in step B. Covalently bonded heparin treatment ionically bonded heparin treatment covalently bonded heparin treatment; D. The material treated by step C was immersed in the mixture of rapamycin solution and PLGA and pulled at a uniform speed for 1-10 minutes, then the vein intima was treated by the same step. After natural drying, it was dried in a 20 C oven for 12 hours. The rapamycin coating is applied to the intima and adventitia of the vein, and the treated bovine jugular vein containing venous valves is implanted into the dog vein to significantly inhibit the proliferation of the intima of the vein and the anastomosis.

【技術實現步驟摘要】
含靜脈瓣的生物源性靜脈的制備方法
本專利技術涉及生物醫學工程，具體地指一種含靜脈瓣的生物源性靜脈的制備方法。
技術介紹
下肢靜脈曲張是臨床上的常見病，易發于45歲以上的人群。患者早期很少出現明顯的臨床癥狀，但到后期則可能出現下肢淺靜脈顯露，伴酸、沉、脹、痛、易疲勞等癥狀，嚴重者可并發血栓性淺靜脈炎、瘀積性皮炎、瘀積性潰瘍、曲張靜脈團出血。下肢靜脈曲張的病因是靜脈瓣功能不全，導致下肢靜脈血液充盈，壓力高，從而靜脈曲張，靜脈曲張導致局部血液循環障礙并影響肢體外觀，目前治療下肢靜脈曲張最有效的方法是高位結扎和大隱靜脈剝離，這類方法都僅僅是對癥治療，無法恢復靜脈瓣的功能，沒有消除靜脈曲張的根本病因，并且對患者傷害大，術后患者恢復比較慢，復發率比較高，還會造成多個手術瘢痕的遺留。生物材料在人體內表現出良好的生物相容性及血流動力學特征，公開號為CN105770991A的中國專利技術專利公開了一種生物源性靜脈瓣膜的制備方法，但將制得的牛的頸靜脈管道植入狗后腔靜脈2周后吻合口處如圖1所示，超聲顯示吻合口直徑0.48厘米，靜脈內直徑0.69厘米，吻合口狹窄部位橫截面積/非吻合口橫截面積＝48.4％，吻合口增生導致吻合口橫截面積下降了51.6％；內膜處如圖2所示，超聲顯示增生處內徑0.53cm，其它處內徑0.7cm，橫截面積減少了43％，血管內膜顯著增生。吻合口及內膜的增生會阻擋血流，造成含靜脈瓣的牛頸靜脈狹窄，甚至閉塞的嚴重后果。因此，需要開發出一種異種植入后靜脈內膜及吻合口內膜增生受到明顯抑制的含有靜脈瓣膜的生物源性靜脈的制備方法。雷帕霉素是一種高效的免疫抑制劑，臨床上多用于器官移植的抗排斥反應和自身免疫性疾病的治療，《局部應用雷帕霉素在預防移植靜脈再狹窄中的作用》(中國動脈硬化雜志；2006年11期)中公開了在已知血管外面局部應用雷帕霉素，可以在一定時間內抑制移植血管的的吻合口增生，從而降低靜脈移植術后的再狹窄發生率。但上述文獻的方法實驗對象是自體血管移植，不涉及免疫排斥反應，把牛的含靜脈瓣的靜脈移植到狗的靜脈屬于異種移植，異種之間產生更大的排斥反應，嚴重會導致靜脈及吻合口狹窄甚至閉塞，對抗免疫排斥反應要求更高，文獻中的方法無法滿足。文獻中處理方式是將雷帕霉素加入生物蛋白膠后注射在移植靜脈的周圍間隙，雷帕霉素被涂抹于血管外膜，雷帕霉素需要滲透過血管壁進入靜脈內膜來起到抑制靜脈內膜增生的作用，靜脈內膜中雷帕霉素的濃度無法得到保證，還有文獻中雷帕霉素是吻合口吻合完畢后使用，不同的手術者和不同的病人在使用量和具體位置有個體差異性，不利于保證效果的穩定性，自體血管移植無法大規模批量生產，限制了推廣，自體血管的獲取對病人造成二次創傷不可忽視。因此，亟待開發出一種制備方法，使含有靜脈瓣的生物源性靜脈內膜上穩定含有高濃度雷帕霉素，能夠更強抑制靜脈內膜和吻合口增生，即使異種植入后也能預防血管內膜和吻合口增生，避免靜脈狹窄和閉塞，而且能夠大規模推廣應用，同時保證穩定的質量，更需要避免病人二次創傷。
技術實現思路
本專利技術的目的就是要解決上述
技術介紹
的不足，提供一種異種植入后靜脈內膜及吻合口增生受到明顯抑制的含靜脈瓣的生物源性靜脈的制備方法。本專利技術的技術方案為：一種預防異種植入后內膜增生的含靜脈瓣的生物源性靜脈的制備方法，其特征在于，步驟為：a、剪取直徑0.5～1.5cm，長3～5cm含有完整瓣膜的豬或牛的頸靜脈管道，清理并消毒；b、對步驟a中得到的材料進行細胞裂解處理、細胞消化及核酸消化處理；c、將經過步驟b處理的材料依次進行共價鍵合肝素處理、離子結合肝素處理、共價鍵合肝素處理；d、將經過步驟c處理的材料浸入雷帕霉素溶液與丙交酯乙交酯共聚物PLGA混合形成的處理液中并且在處理液中勻速拉動1～10分鐘，再將靜脈內膜外翻浸入處理液中勻速拉動1～10分鐘，取出放置于空氣中自然晾干至溶液完全揮發，烘干保存；每1L所述雷帕霉素溶液由125～500mg雷帕霉素溶于100～200ml無水乙醇后加入PBS溶液定容得到，每1L雷帕霉素溶液與500～1000mgPLGA混合。優選的，所述每1L雷帕霉素溶液由250mg雷帕霉素溶于125ml無水乙醇后加入PBS溶液定容得到。優選的，每1L雷帕霉素溶液與750gPLGA混合。優選的，所述共價鍵合肝素處理過程為：浸入1mol/L羥胺硫酸鹽溶液中，室溫下處理12h后用蒸餾水漂洗，浸入heparin-EDC液中進行肝素交聯處理，隨后用PBS溶液沖洗；肝素交聯的條件為37℃下搖動交聯48～72h。優選的，所述離子結合肝素處理過程為：浸入含1mg/mLPEI的0.15MNaCl水溶液中，室溫下處理30min后用PBS溶液沖洗，浸入含0.5mg/mL肝素鈉的PBS溶液中室溫下處理30min后用PBS溶液沖洗，再重復執行上述操作14遍。優選的，所述步驟b、c中的處理過程均在搖動轉速為70～100rpm的搖床中進行。本專利技術利用雷帕霉素抑制增生的原理，將雷帕霉素涂層于血管內膜和外膜，然后移植于異種靜脈，使靜脈內膜含有高濃度的雷帕霉素，防止靜脈內膜及吻合口異常增生導致靜脈狹窄、閉塞。本專利技術的有益效果為：1.通過靜脈管道正反面兩次浸入雷帕霉素處理液中，使雷帕霉素從血管內膜和外膜兩側進行附著滲透，浸入處理液時勻速拉動使雷帕霉素與內膜、外膜均勻結合，使處理后的血管均勻含有高濃度的雷帕霉素。2.體外完成雷帕霉素涂層，有利于保證血管內膜上的雷帕霉素濃度穩定，消除個體吸收造成藥物作用濃度的差異性。3.雷帕霉素易于得到，已經商業化生產，提高了大規模處理含靜脈瓣的牛頸靜脈的可行性。4.處理工藝清晰明了，保證了大規模處理質量的穩定性。5.避免了獲取自體血管造成的二次創傷。附圖說明圖1為現有技術得到的含靜脈瓣的牛頸靜脈植入狗后腔靜脈后吻合口超聲圖圖2為現有技術得到的含靜脈瓣的牛頸靜脈植入狗后腔靜脈后靜脈內膜超聲圖圖3為本專利技術制得的含靜脈瓣的牛頸靜脈植入狗后腔靜脈超聲圖具體實施方式下面具體實施例對本專利技術作進一步的詳細說明。實施例1a、取直徑在0.5～1.5cm并帶有瓣膜的屠宰場日常宰殺的新鮮牛頸靜脈管道，翻面后找到瓣膜部分，剪取長3～5cm含有完整瓣膜的區段，翻回正面后修剪掉靜脈外周脂肪組織及多余的結締組織，并用生理鹽水順行灌洗清除淤血塊，再浸入0.1％(W/V)新潔爾滅溶液中消毒30min后用PBS溶液沖洗干凈備用。b、使用含0.5％(W/V)TritonX-100的PBS液處理步驟a中得到的材料48h，裂解細胞，并用PBS溶液沖洗。再浸入含0.025％(W/V)胰蛋白酶及0.02％(W/V)EDTA的PBS溶液(0.025g胰蛋白酶，0.02gEDTA溶于100mLPBS溶液中)中處理30min，消化細胞，并用PBS溶液沖洗。最后浸入含30u/mlDNaseI及0.3mg/mlRNaseA的PBS溶液中處理24h，消化核酸，并用PBS溶液沖洗；各處理過程均在37℃下，搖動轉速70～100rpm的搖床中進行。c、共價鍵合肝素處理：將上述處理的材料浸入1mol/L羥胺硫酸鹽溶液中，室溫下以70～100rpm搖動轉速處理12h后用蒸餾水漂洗3次，每次10min，浸入heparin-EDC液(1.67gEDC+0.835g肝素鈉+0.05mol/LHC本文檔來自技高網...

【技術保護點】
1.一種含靜脈瓣的生物源性靜脈的制備方法，其特征在于，步驟為：a、剪取直徑0.5～1.5cm，長3～5cm含有完整瓣膜的豬或牛的頸靜脈管道，清理并消毒；b、對步驟a中得到的材料進行細胞裂解處理、細胞消化及核酸消化處理；c、將經過步驟b處理的材料依次進行共價鍵合肝素處理、離子結合肝素處理、共價鍵合肝素處理；d、將經過步驟c處理的材料浸入雷帕霉素溶液與丙交酯乙交酯共聚物PLGA混合形成的處理液中并且在處理液中勻速拉動1～10分鐘，再將靜脈內膜外翻浸入處理液中勻速拉動1～10分鐘，取出放置于空氣中自然晾干至溶液完全揮發，烘干保存；每1L所述雷帕霉素溶液由125～500mg雷帕霉素溶于100～200ml無水乙醇后加入PBS溶液定容得到，每1L雷帕霉素溶液與500～1000mgPLGA混合。

【技術特征摘要】
1.一種含靜脈瓣的生物源性靜脈的制備方法，其特征在于，步驟為：a、剪取直徑0.5～1.5cm，長3～5cm含有完整瓣膜的豬或牛的頸靜脈管道，清理并消毒；b、對步驟a中得到的材料進行細胞裂解處理、細胞消化及核酸消化處理；c、將經過步驟b處理的材料依次進行共價鍵合肝素處理、離子結合肝素處理、共價鍵合肝素處理；d、將經過步驟c處理的材料浸入雷帕霉素溶液與丙交酯乙交酯共聚物PLGA混合形成的處理液中并且在處理液中勻速拉動1～10分鐘，再將靜脈內膜外翻浸入處理液中勻速拉動1～10分鐘，取出放置于空氣中自然晾干至溶液完全揮發，烘干保存；每1L所述雷帕霉素溶液由125～500mg雷帕霉素溶于100～200ml無水乙醇后加入PBS溶液定容得到，每1L雷帕霉素溶液與500～1000mgPLGA混合。2.如權利要求1所述的含靜脈瓣的生物源性靜脈的制備方法，其特征在于，步驟d中所述每1L雷帕霉素溶液由250mg雷帕霉素溶于125ml無水乙醇后加入PBS溶液定容得到...

【專利技術屬性】
技術研發人員：曾祥軍，
申請(專利權)人：曾祥軍，
類型：發明
國別省市：湖北,42